一、電子顯微鏡與光學顯微鏡的主要區別

顯微鏡的分辨率取決於所用光的波長，1933年(nian)開(kai)始(shi)出(chu)現(xian)的(de)電(dian)子(zi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)正(zheng)是(shi)由(you)於(yu)使(shi)用(yong)了(le)波(bo)長(chang)比(bi)可(ke)見(jian)光(guang)短(duan)得(de)多(duo)的(de)電(dian)子(zi)束(shu)作(zuo)為(wei)光(guang)源(yuan)，使(shi)其(qi)所(suo)能(neng)達(da)到(dao)的(de)分(fen)辨(bian)率(lv)較(jiao)光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)大(da)大(da)提(ti)高(gao)。而(er)光(guang)源(yuan)的(de)不(bu)同(tong)，也(ye)決(jue)定(ding)了(le)電(dian)子(zi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)與(yu)光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)一(yi)係(xi)列(lie)差(cha)異(yi)。

根據電子束作用於樣品的方式的不同及成像原理的差異，現代電子顯微鏡已發展形成了許多種類型
，目前最常用的是透射電子顯微鏡（transmission electron microscope）和掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope)
，前者總放大倍數可在1000-1000000倍範圍內變化，後者總放大倍數可在20-300000倍之間變化。本實驗主要介紹這兩種顯微鏡樣品的製備。

二、器材

1.菌種 大腸杆菌（大腸埃希氏菌，Escherichia coli）斜麵。

2.溶液或試劑  醋酸戊脂，濃硫酸，無水乙醇，無菌水，2%磷鎢酸鈉（pH6.5-8.0）水溶液，0.3%聚乙烯甲醛（溶於三氯甲烷）溶液，細胞色素c，醋酸銨，質粒pBR322。

3.儀器或其他用具 普通光學顯微鏡
，銅網，瓷漏鬥，燒杯
，平皿
，無菌滴管

，無菌鑷子，大頭針
，載玻片，細菌計數板，真空鍍膜機，臨界點幹燥儀等。

三
、操作步驟

（一）透射電鏡的樣品製備及觀察

1.金屬網的處理

光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)樣(yang)品(pin)是(shi)放(fang)置(zhi)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)進(jin)行(xing)觀(guan)察(cha)。而(er)在(zai)透(tou)射(she)電(dian)鏡(jing)中(zhong)，由(you)於(yu)電(dian)子(zi)不(bu)能(neng)穿(chuan)透(tou)玻(bo)璃(li)，隻(zhi)能(neng)采(cai)用(yong)網(wang)狀(zhuang)材(cai)料(liao)作(zuo)為(wei)載(zai)物(wu)
，通(tong)常(chang)稱(cheng)為(wei)載(zai)網(wang)。載(zai)網(wang)因(yin)材(cai)料(liao)及(ji)形(xing)狀(zhuang)的(de)不(bu)同(tong)可(ke)分(fen)為(wei)多(duo)種(zhong)不(bu)同(tong)的(de)規(gui)格(ge)

，其(qi)中(zhong)最(zui)常(chang)用(yong)的(de)是(shi)200-400目（孔數）的銅網。網在使用前要處理，除去其上的汙物，否則會影響支持膜的質量及標本照片的清晰度。本實驗選用的是400目的銅網
，可用如下方法進行處理：首shou先xian用yong醋cu酸suan戊wu酯zhi浸jin漂piao幾ji小xiao時shi，再zai用yong蒸zheng餾liu水shui衝chong洗xi數shu次ci，然ran後hou再zai將jiang銅tong網wang浸jin漂piao在zai無wu水shui乙yi醇chun中zhong進jin行xing脫tuo水shui。如ru果guo銅tong網wang經jing以yi上shang方fang法fa處chu理li仍reng不bu幹gan淨jing時shi
，可ke用yong稀xi釋shi的de濃nong硫liu酸suan（1：1）浸1~2分鍾，或在1% NaOH 溶液中煮沸數分鍾，用蒸餾水衝洗數次後，放入無水乙醇中脫水，待用。

2.支持膜的製備

在進行樣品觀察時，在載網上還應覆蓋一層無結構
、均勻的薄膜，否則細小的樣品會從載網的孔中漏出去，這層薄膜通常稱為支持膜或載膜。支持膜應對電子透明
，其厚度一般應低於20nm；在電子束的衝擊下，該膜還應有一定的機械強度，能保持結構的穩定，並擁有良好的導熱性；此外，支持網在電鏡下應無可見的結構，且不與承載的樣品發生化學反應，不幹擾對樣品的觀察，其厚度一般為15nm左右。支持膜可用塑料膜（如火棉膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鈹膜等）。常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求
，而塑料膜中火棉膠膜的製備相對容易，但強度不如聚乙烯甲醛膜。

（1）火棉膠棉的製備

在一幹淨容器（燒杯、平皿或下帶止水夾的瓷漏鬥）中放入一定量的無菌水

，用無菌滴管吸2%火huo棉mian膠jiao醋cu酸suan戊wu酯zhi溶rong液ye，滴di一yi滴di於yu水shui麵mian中zhong央yang

，勿wu振zhen動dong，待dai醋cu酸suan戊wu酯zhi蒸zheng發fa
，火huo膜mo膠jiao則ze由you於yu水shui的de張zhang力li隨sui即ji在zai水shui麵mian上shang形xing成cheng一yi層ceng薄bo膜mo。用yong鑷nie子zi將jiang它ta除chu掉diao
，再zai重zhong複fu一yi次ci此ci操cao作zuo，主zhu要yao是shi為wei了le清qing除chu水shui麵mian上shang的de雜za質zhi。然ran後hou適shi量liang滴di一yi滴di火huo棉mian膠jiao液ye於yu水shui麵mian，火huo棉mian膠jiao液ye滴di加jia量liang的de多duo少shao與yu形xing成cheng膜mo的de厚hou薄bo有you關guan


，待dai膜mo形xing成cheng後hou，檢jian查zha是shi否fou有you皺zhou折zhe，如ru有you
，則ze除chu去qu一yi直zhi待dai膜mo製zhi好hao。

所用溶液中不能有水分及雜質，否則形成的膜的質量較差。待膜成型後，可以側麵對光檢查所形成的膜是否平整及是否有雜質。

（2）聚乙烯甲醛膜（formvar 膜）的製備

①洗幹淨的玻璃板插入0.3% formvar溶液中靜置片刻（時間視所要求的膜的厚度而定），然後取出稍稍晾幹便會在玻璃板上便形成一層薄膜
；

②用鋒利的刀片或針頭將膜刻一矩形；

③將玻板輕輕斜插進盛滿無菌水的容器中，借助水的表麵張力作用使膜與玻片分離並漂浮在水麵上。

所使用的玻片一定要幹淨
，否則膜難以從上麵脫落；漂浮膜時，動作要輕
，手不能發抖，否則膜將發皺
；同時，操作時應注意防風避塵，環境要幹燥，所用溶劑也必需有足夠的純度，否則都將對膜的質量產生不良影響。

3.轉移支持膜到載網上

轉移支持膜到載網上，可有多種方法
，常用的有如下二種：

（1）將洗淨的網放入瓷漏鬥中，漏鬥下套上乳膠管
，用止水夾控製水流，緩緩向漏鬥內加入無菌水，其量約高1厘米；用無菌鑷子尖輕輕排除銅網上的氣泡，並將其均勻地擺在漏鬥中心區域；按2所述方法在水麵上製備支持膜
，然後鬆開水夾

，使膜緩緩下沉，緊緊貼在銅網上
；將jiang一yi清qing潔jie的de濾lv紙zhi覆fu蓋gai地di漏lou鬥dou上shang防fang塵chen
，自zi然ran幹gan燥zao或huo紅hong外wai線xian燈deng下xia烤kao幹gan。幹gan燥zao後hou的de膜mo
，用yong大da頭tou針zhen尖jian在zai銅tong網wang周zhou圍wei劃hua一yi下xia，用yong無wu菌jun鑷nie子zi小xiao心xin將jiang銅tong網wang膜mo移yi到dao載zai玻bo片pian上shang，置zhi光guang學xue顯xian微wei鏡jing下xia用yong低di倍bei鏡jing挑tiao選xuan完wan整zheng無wu缺que、厚薄均勻的銅網膜備用。

（2）按2所suo述shu方fang法fa在zai平ping皿min或huo燒shao杯bei裏li製zhi備bei支zhi持chi膜mo，成cheng膜mo後hou將jiang幾ji片pian銅tong網wang放fang在zai膜mo上shang，再zai在zai上shang麵mian放fang一yi張zhang濾lv紙zhi，浸jin透tou後hou用yong鑷nie子zi將jiang濾lv紙zhi反fan轉zhuan提ti出chu水shui麵mian。將jiang有you膜mo及ji銅tong網wang的de一yi麵mian朝chao上shang放fang在zai幹gan淨jing平ping皿min中zhong，置zhi40℃烘箱使幹燥。

4.製片

  透射電鏡樣品的製備方法很多，如超薄切片法、複型法、冰凍蝕刻法、滴液法等。其中滴液法，或在滴液法基礎上發展出來的其他類似方法如直接貼印法
、噴霧法等主要被用於觀察病毒粒子、細菌的形態及生物大分子等。而由於生物樣品主要由碳、氫、氧、dandengyuansuzucheng
，sanshedianzidenenglihendi
，zaidianjingxiafanchaxiao，suoyizaijinxingdianjingdeshengwuyangpinzhibeishitongchanghaixucaiyongzhongjinshuyanransehuojinshuyanpendudengfangfalaizengjiayangpindefancha，tigaoguanchaxiaoguo。lirufuransefajiushiyongdianzimidugao，benshenbuxianshijiegouqieyuyangpinjihubufanyingdewuzhi（如磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來對樣品進行“染色”。youyuzhexiezhongjinshuyanbubeiyangpinwanfensuoxifuershichenjidaoyangpinsizhou，ruguoyangpinjuyoubiaomianjiegou
，zhezhongwuzhihainengchuantoujinbiaomianshangaoxiandebufen，yinerzaiyangpinsizhouyouranyechenjidedifang
，sanshedianzidenengliqiang，biaoxianweianqu，erzaiyouyangpindedifangsanshedianzidenengliruo


，biaoxianweiliangqu。zheyangbiannengbayangpindewaixingyubiaomianjiegouqingchudichentuochulai。furansefayouyucaozuojiandan，muqianzaijinxingtoushedianjingshengwuyangpinzhipianshibijiaochangyong。benshiyanjiangzhuyaojieshaocaiyongdiyefajiehefuransejishuguanchaxijunjihesuanfenzidexingtai。

（1）細菌的電鏡樣品製備

①將適量無菌水加入生長良好的細菌斜麵內
，用吸管輕輕撥動菌體製成菌懸液。用無菌濾紙過濾，並調整濾液中的細胞濃渡為108~109個/亳升。

②取等量的上述菌懸液與等量的2%的磷鎢酸鈉水溶液混合，製成混合菌懸液。

③用菌毛細吸管吸取混合菌懸液滴在銅網膜上。

④經3~5分鍾後，用濾紙吸去餘水
，待樣品幹燥後
，置低倍光學顯微鏡下檢查，挑選膜完整、菌體分布均勻的銅網。

有時為了保持菌體的原有形狀
，常用戊二醛、甲醛、鋨酸蒸氣等試劑小固定後再進行染色。其方法是將用無菌水製備好的菌懸液經過過濾，然後向濾液中加幾滴固定液（如pH7.2

，0.15%的戊二醛磷酸緩衝液），經這樣預先稍加固定後，離心

，收集菌體，再用無菌水製成菌懸液，並調整細胞濃度為108-109個/毫升。然後按上述方法染色。

（2）核酸分子的電鏡樣品製備

核he酸suan分fen子zi鏈lian一yi般ban較jiao長chang，采cai用yong普pu通tong的de滴di液ye或huo噴pen霧wu法fa易yi使shi其qi結jie構gou受shou到dao破po壞huai
，因yin此ci目mu前qian多duo采cai用yong蛋dan白bai質zhi分fen子zi膜mo技ji術shu來lai進jin行xing核he酸suan分fen子zi樣yang品pin的de製zhi備bei。其qi原yuan理li是shi：很hen多duo球qiu狀zhuang蛋dan白bai均jun能neng在zai水shui溶rong液ye或huo鹽yan溶rong液ye的de表biao麵mian形xing成cheng不bu溶rong的de變bian性xing薄bo膜mo，在zai適shi當dang的de條tiao件jian下xia這zhe一yi薄bo膜mo可ke以yi成cheng為wei單dan分fen子zi層ceng
，由you伸shen展zhan的de肽tai鏈lian構gou成cheng一yi個ge分fen子zi網wang。當dang核he酸suan分fen子zi與yu該gai蛋dan白bai質zhi單dan分fen子zi膜mo作zuo用yong時shi，會hui由you於yu蛋dan白bai質zhi的de氨an基ji酸suan堿jian性xing側ce鏈lian基ji團tuan的de作zuo用yong
，使shi得de核he酸suan從cong三san維wei空kong間jian結jie構gou的de溶rong液ye構gou型xing吸xi附fu於yu肽tai鏈lian網wang而er轉zhuan化hua為wei二er維wei空kong間jian的de構gou型xing，並bing從cong形xing態tai到dao結jie構gou均jun能neng保bao持chi一yi定ding程cheng度du的de完wan整zheng性xing。最zui後hou將jiang吸xi附fu有you核he酸suan分fen子zi的de蛋dan白bai質zhi單dan分fen子zi膜mo轉zhuan移yi到dao載zai膜mo上shang，用yong負fu染ran等deng方fang法fa增zeng加jia樣yang品pin的de反fan差cha後hou置zhi電dian鏡jing觀guan察cha。可ke用yong展zhan開kai法fa
、擴散法、一步稀釋法等使核酸吸附到蛋白質單分子膜上

，本實驗采用展開法。

①將質粒pBR322與一堿性球狀蛋白溶液（一般為細胞色素c）混合，使濃度分別達到0.5-2 mg/ml和0.1mg/ml，並加入終濃度為0.5-1mol/L的醋酸銨和1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉
，成為展開溶液，pH為7.5。

②在一幹淨的平皿中注入一定下相溶液（蒸餾水或0.1-0.5mol/L的醋酸銨溶液）

，並在液麵上加入少量滑石粉。將一幹淨載玻片斜放於平皿中

，用微量注射器或移液槍吸取50μl的展開溶液
，在離下相溶液表麵約1cm左右的載玻片上前後擺動
，滴於載玻片的表麵

，此時可看到滑石粉層後退，說明蛋白質單分子膜逐漸形成，整個過程約需2-3min。載玻片傾斜的角度決定了展開液下滑至下相溶液的速度
，並對單分子膜的形成質量有影響，經驗證明傾斜度以150左zuo右you為wei宜yi。在zai蛋dan白bai形xing成cheng單dan分fen子zi膜mo時shi
，溶rong液ye中zhong的de核he酸suan分fen子zi也ye同tong時shi分fen布bu於yu蛋dan白bai質zhi基ji膜mo中zhong間jian，並bing略lve受shou蛋dan白bai質zhi肽tai鏈lian的de包bao裹guo。理li論lun計ji算suan及ji實shi驗yan證zheng明ming，當dang1mg的蛋白質展開成良好的單分子膜時，其麵積約為1cm2，yinerkegenjuzuihouxingchengdedanfenzimomianjidedaxiaogujiqihaohuaichengdu。ruguomianjiguoxiao，shuomingxingchengdemobingfeidanfenziceng，yinerhesuanjiuyoujubuhuoquanbubeimobaoguodeweixian，shizhenggehesuanfenzixiaoshihuofanchabianhuai。

zaidanfenzimoxingchengshizhenggezhuangzhizuihaoyongbolizhaodengwugaizhu
，yifangcaozuorenyuandehuxihepangrenzoudongdengyinqiqiliudeyingxiangyijihuichendengzangwudewuran。lingwai，zaizhankairongyezhongkeshiliangjiaruyixieyuhesuanliangxiangchabuguoxuanshudezhishibiaoben，ruyancaohuayebingbingdudeng
，yiliyujiandingdanfenzimodezhankaijihoumianzhuanyidehaohuai。

③單分子膜形成後
，用電鏡鑷子取一覆有支持膜的載網，使支持膜朝下
，放置於離單分子膜前沿1cm或距載玻片0.5cm的膜表麵上，並用鑷子即刻撈起，單分子膜即吸附於支持膜上。多餘的液體可用小片濾紙吸去，也可將載網直接漂浮於無水乙醇中10-30s。

④將載有單分子膜的載網置於10-3-10-5mol/L的醋酸鈾乙醇溶液中染色約30s（此步可在用乙醇脫水時同時進行）
，或huo用yong旋xuan轉zhuan投tou影ying的de方fang法fa將jiang金jin屬shu噴pen鍍du於yu核he酸suan樣yang品pin的de表biao麵mian。也ye可ke將jiang二er種zhong方fang法fa結jie合he起qi來lai，在zai染ran色se後hou再zai進jin行xing投tou影ying，其qi效xiao果guo有you時shi比bi單dan獨du使shi用yong一yi種zhong方fang法fa更geng好hao一yi些xie。

5.觀察

將載有樣品的銅網置於透射電鏡中進行觀察。
（二） 掃描電鏡微生物樣品的製備及觀察

掃描電鏡觀察時要求樣品必需幹燥
，並且表麵能夠導電。因此，在進行掃描電鏡微生物樣品製備時一般都需采用固定、脫水

、幹燥及表麵鍍金等處理步驟。

1.固定及脫水

生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)的(de)精(jing)細(xi)結(jie)構(gou)易(yi)遭(zao)破(po)壞(huai)
，因(yin)此(ci)在(zai)進(jin)行(xing)製(zhi)樣(yang)處(chu)理(li)和(he)進(jin)行(xing)電(dian)鏡(jing)觀(guan)察(cha)前(qian)必(bi)需(xu)進(jin)行(xing)固(gu)定(ding)，以(yi)使(shi)其(qi)能(neng)最(zui)大(da)限(xian)度(du)地(di)保(bao)持(chi)其(qi)生(sheng)活(huo)時(shi)的(de)形(xing)態(tai)。而(er)采(cai)用(yong)水(shui)溶(rong)性(xing)、dibiaomianzhanglideyoujirongyeruyichundengduiyangpinjinxingtidutuoshui
，yeshiweilezaiduiyangpinjinxingganzaochulishijinliangjianshaoyoubiaomianzhangliyinqideqiziranxingtaidebianhua。

將處理好的、幹淨的蓋玻片，切割成4-6mm2dexiaokuai
，jiangdaijiandejiaonongdedachangganjunxuanfuyedijiaqishang，huojiangjuntaizhijietushang
，yekeyonggaibopianxiaokuaizhantiejunluobiaomian，ziranganzaohouzhiguangxuexianweijingjingjian，yijuntijiaomi，danyoubuduizaiyiqiweiyi；標記蓋玻片小塊有樣品的一麵；將上述樣品置於1%-2%戊二醛磷酸緩衝液（pH7.2左右）中，於40度冰箱中固定過夜。次日以0.15%的同一緩衝液衝洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分別依次脫水
，每次15min。脫水後，用醋酸戊脂置換乙醇。

另一種與之類似的樣品製備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最後塗布到玻片上。其優點是：①在固定及脫水過程中可完全避免菌體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然幹燥而引起的菌體變形；②可保證最後製成的樣品中有足夠的菌體濃度，因為塗在玻片上的菌體在固定及幹燥過程中有時會從玻片上脫落；③確保玻片上有樣品的一麵不會弄錯。

2.幹燥

將上述製備的樣品置於臨界點幹燥器中
，浸泡於液態二氧化碳中，加熱到臨界點溫度（31.40，72.8個大氣壓）以上，使之氣化進行幹燥。

yangpinjingtuoshuihou，youjirongjipaijileshuifen
，qinzhanleyuanlaishuideweizhi。shuishituodiaole，danyangpinhaishijinrunzairongjizhong，haibixuzaibiaomianzhanglijinkenengxiaodeqingkuangxiajiangzhexierongji“請”出去，使樣品真正得到幹燥。目前采用最多、效xiao果guo最zui好hao的de方fang法fa是shi臨lin界jie點dian幹gan燥zao法fa。其qi原yuan理li是shi在zai一yi裝zhuang有you溶rong液ye的de密mi閉bi容rong器qi中zhong
，隨sui著zhe溫wen度du的de升sheng高gao，蒸zheng發fa速su率lv加jia快kuai，氣qi相xiang密mi度du增zeng加jia
，液ye相xiang密mi度du下xia降jiang。當dang溫wen度du增zeng加jia到dao某mou一yi定ding值zhi時shi，氣qi、液(ye)二(er)相(xiang)密(mi)度(du)相(xiang)等(deng)
，界(jie)麵(mian)消(xiao)失(shi)，表(biao)麵(mian)張(zhang)力(li)也(ye)就(jiu)不(bu)存(cun)在(zai)了(le)。此(ci)時(shi)的(de)溫(wen)度(du)及(ji)壓(ya)力(li)即(ji)稱(cheng)為(wei)臨(lin)界(jie)點(dian)。將(jiang)生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)用(yong)臨(lin)界(jie)點(dian)較(jiao)低(di)的(de)物(wu)質(zhi)置(zhi)換(huan)出(chu)內(nei)部(bu)的(de)脫(tuo)水(shui)劑(ji)進(jin)行(xing)幹(gan)燥(zao)，可(ke)以(yi)完(wan)全(quan)消(xiao)除(chu)表(biao)麵(mian)張(zhang)力(li)對(dui)樣(yang)品(pin)結(jie)構(gou)的(de)破(po)壞(huai)。目(mu)前(qian)用(yong)得(de)最(zui)多(duo)的(de)置(zhi)換(huan)劑(ji)是(shi)二(er)氧(yang)化(hua)碳(tan)。由(you)於(yu)二(er)氧(yang)化(hua)碳(tan)與(yu)乙(yi)醇(chun)的(de)互(hu)溶(rong)性(xing)不(bu)好(hao)
，因(yin)此(ci)樣(yang)品(pin)經(jing)乙(yi)醇(chun)分(fen)級(ji)脫(tuo)水(shui)後(hou)還(hai)需(xu)用(yong)與(yu)這(zhe)兩(liang)種(zhong)物(wu)質(zhi)都(dou)能(neng)互(hu)溶(rong)的(de)“媒介液”醋酸戊脂置換乙醇。

3.噴鍍及觀察

將樣品放在真空鍍膜機內，把金噴鍍到樣品表麵後
，取出樣品在掃描電鏡中進行觀察。