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秘訣1：由強到弱
秘訣2：三倍規則
秘訣3：粗調轉微調
kaifafangfahuofangfayanzhengshizuizhongyaodeyibujiushiliudongxiangdexuanzehebilidetiaozheng。woxiangdajiakendingdouyudaoguofenlidubuhaohuofengxingbuhaodeqingkuang，dabufenyuanyin就是流動相沒調好，那到底該怎麼調，怎麼選擇呢？看完下文可能你就知道答案了。
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩衝溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動相的性質要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特征。 選擇流動相時應考慮以下幾個方麵： ①liudongxiangyingbugaibiantianliaoderenhexingzhi。dijiaoliandudelizijiaohuanshuzhihepaizuseputianliaoyoushiyudaomouxieyoujixianghuirongzhanghuoshousuo，congergaibiansepuzhutianchuangdexingzhi。堿性流動相不能用於矽膠柱係統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱係統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢(jian)測(ce)器(qi)時(shi)，所(suo)用(yong)流(liu)動(dong)相(xiang)在(zai)檢(jian)測(ce)波(bo)長(chang)下(xia)應(ying)沒(mei)有(you)吸(xi)收(shou)，或(huo)吸(xi)收(shou)很(hen)小(xiao)。當(dang)使(shi)用(yong)示(shi)差(cha)折(zhe)光(guang)檢(jian)測(ce)器(qi)時(shi)，應(ying)選(xuan)擇(ze)折(zhe)光(guang)係(xi)數(shu)與(yu)樣(yang)品(pin)差(cha)別(bie)較(jiao)大(da)的(de)溶(rong)劑(ji)作(zuo)流(liu)動(dong)相(xiang)，以(yi)提(ti)高(gao)靈(ling)敏(min)度(du)。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的pH值 采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑製樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑製技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘餘矽醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶於水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶於水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應製取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應合成。用於製橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用於合成四級銨化合物。)
3. 如何選擇緩衝液PH值在選擇緩衝液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高於或低於Pka兩個PH值單位的，有助於獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高於或低於Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等於4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等於2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等於6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩衝液PH值等於2.2時，中性化合物以羧酸形式保留於反相柱。
4．流動相的脫氣 HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在係統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。
對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。
超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液麵不要高出水麵太多。
離線（係統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（係統內）脫(tuo)氣(qi)法(fa)無(wu)此(ci)缺(que)點(dian)。最(zui)常(chang)用(yong)的(de)在(zai)線(xian)脫(tuo)氣(qi)法(fa)為(wei)鼓(gu)泡(pao)，即(ji)在(zai)色(se)譜(pu)操(cao)作(zuo)前(qian)和(he)進(jin)行(xing)時(shi)，將(jiang)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)噴(pen)入(ru)溶(rong)劑(ji)中(zhong)。嚴(yan)格(ge)來(lai)說(shuo)，此(ci)方(fang)法(fa)不(bu)能(neng)將(jiang)溶(rong)劑(ji)脫(tuo)氣(qi)，它(ta)隻(zhi)是(shi)用(yong)一(yi)種(zhong)低(di)溶(rong)解(jie)度(du)的(de)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一(yi)般(ban)說(shuo)來(lai)有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)中(zhong)的(de)氣(qi)體(ti)易(yi)脫(tuo)除(chu)，而(er)水(shui)溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)氣(qi)體(ti)較(jiao)頑(wan)固(gu)。在(zai)溶(rong)液(ye)中(zhong)吹(chui)氦(hai)是(shi)相(xiang)當(dang)有(you)效(xiao)的(de)脫(tuo)氣(qi)方(fang)法(fa)，這(zhe)種(zhong)連(lian)續(xu)脫(tuo)氣(qi)法(fa)在(zai)電(dian)化(hua)學(xue)檢(jian)測(ce)時(shi)經(jing)常(chang)使(shi)用(yong)。但(dan)氦(hai)氣(qi)昂(ang)貴(gui)，難(nan)於(yu)普(pu)及(ji)。
5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）lvmo。youjixianglvmoyibanyongyuguolvyoujirongji，guolvshuirongyeshiliusudihuolvbudong。shuixianglvmozhinengyongyuguolvshuirongye，yanjinyongyuyoujirongji，fouzelvmohuibeirongjie！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑，導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC係統中的不鏽鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不鏽鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和幹燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
