適用

bioxl三聚氰胺檢測試劑盒是利用酶聯免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。

 

檢測原理

酶mei聯lian免mian疫yi吸xi附fu測ce定ding法fa定ding量liang測ce定ding三san聚ju氰qing胺an殘can留liu。利li用yong萃cui取qu液ye通tong過guo均jun質zhi及ji振zhen蕩dang的de方fang式shi提ti取qu樣yang品pin中zhong的de三san聚ju氰qing胺an進jin行xing免mian疫yi測ce定ding。先xian將jiang三san聚ju氰qing胺an酶mei標biao記ji物wu
，樣yang品pin萃cui取qu物wu及ji標biao準zhun加jia入ru到dao已yi經jing包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應。在30分鍾的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30fenzhonghouxidiaoxiaokongzhongsuoyoumeiyoujiehedesanjuqinganjisanjuqinganmeibiaojiwu。zaiyongqulizishuiqingxijieshuhou，meikongzhongjiaruqingchedediwurongye，jiehedemeibiaojiwujiangwusedediwuzhuanhuaweilansedewuzhi。fuyu30分鍾後停止此反應，根據各孔顏色深淺進行數據讀取。依據標準的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

 

提供試劑及材料

試劑盒在2-8ºC貯存（不要冷凍），請於盒上標注日期前用完。

1．空包裝微孔板 （8×12條）.

2．4瓶三聚氰胺標準液2mL，濃度分別為 0,20,100, 500 µg/L (ppb) .

3．1 瓶 7 mL 三聚氰胺酶標記

4．1 瓶 14 mL 底物.

5．1 瓶 14 mL 停止液. (注意: 1N 鹽酸, 勿接觸皮膚!).

6．操作說明書.

 

注意事項

1．最好配套使用本試劑盒所提供的試劑
，不要同其它公司的產品混用，不要將不同批次的產品混用。

2．樣品稀釋或含有雜質很可能對結果的準確性有影響。

3．不要使用過期的產品。

4．使用之前將所有試劑回升至室溫20-280C，但不要放置超過24小時。

5．三聚氰胺屬於有毒性的化學品，請小心處理。

6．停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。

 

試劑盒未提供的材料

1.    蒸餾水或去離子水..

2.    可吸取50ul的移液器及吸頭.

3.    可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.

4.    吸水紙或相當的吸水材料.

5.    450nm的酶標儀.

6.    計時器.

7.    20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.

8．清洗液：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml+.0.5 ml土溫20。

樣品製備

濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數：100）

1.    均質樣品至布丁狀。

2.    稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，並劇烈振蕩。

3.    超聲萃取1分鍾。

4.    漩渦混合1分鍾，然後靜置5分鍾，使樣品分層。

5.    3000 g 室溫離心5分鍾。

6.    用玻璃纖維濾紙過濾上清液，並將萃取液收集於一幹淨試管中。

7.    用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）

8.    移取150 ul 進行分析。

注意：用此方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率範圍為75%-117%。

本方法隻可作為樣品篩選方法，不可作為最終確認方法。

 

小麥麵筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數：500）

1.均質或混勻小麥麵筋蛋白樣品。

2.稱取0.2g均質好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。

3.漩渦混合並超聲萃取，使樣品溶解（確保樣品中沒有結塊）。

4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。

5.10000轉/分離心上清液10分鍾。

6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，並將萃取液收集於一幹淨試管中。

7.移取150 ul 進行分析。

 

注意：如果樣品中含有大量的添加物
，需要加入更大量的萃取溶液，以保證萃取效率。

操作人依據自己的判斷力，如果測試結果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進行二次測定。

 

幹的寵物食品萃取方法（稀釋倍數：200）

1.質器均質幹的寵物飼料樣品。

2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，並劇烈振蕩。

3.超聲萃取1分鍾。漩渦混合1分鍾，然後靜置5分鍾，使樣品分層。

4.3000 g 室溫離心5分鍾。

5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，並將萃取液收集於一幹淨試管中。

6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）

7.移取

牛奶樣品

1直接法

—4℃
，2000g離心l5min，撇去上層脂肪

—取50ul用於檢測。

注意：對於酸奶樣品，應將pH值調節至中性再進行檢測。

2抽提法

—5ml牛奶樣品
，O-4℃

，2000g離心l5min，撇去上層脂肪

—轉移2.5m1脫脂奶到玻管與5ml乙酸乙酯混合，渦旋1min，靜置5-10min令其發生相分離

—轉移4ml乙酸乙酯上層到幹淨玻璃管中，50℃溫和氮流蒸發乙酸乙酯

—殘留物溶解於200ul稀釋緩衝液(2ml牛奶/200ul緩衝液)

—取50ul用於檢測

（脫脂奶粉處理方法：將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉，再按上述步驟操作）

 

 

免疫測定過程 (注意: 標準及樣品最好做平行試驗以增加準確度)

1.    將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放置超過24小時。

2.    從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條
，放入幹燥劑並重新封好袋子以免微孔條受潮

3.    吸取150ul標準
、樣品到對應微孔中，必須保證每種溶液使用幹淨的吸頭吸取，避免交叉汙染。 加入50ul三聚氰胺酶標記溶液到每個小孔中。

4.    混合60秒

，20-28攝氏度下孵育30分鍾。

6.    將微孔中的溶液倒入水槽中，用清洗液完全充滿微孔，震蕩後倒掉，重複三次

，總共四次洗板。

7.    在吸水紙上拍打，盡可能將水拍幹。

8.    每個微孔中加入100ul底物溶液。

9.    20-28攝氏度下
，孵育30分鍾。

10. 每個微孔中加入100ul停止液。

11. 450nm下讀板。

 

結果分析

1.    半定量的結果是由樣品的吸光率與標準的吸光率的簡單對比而來判定:樣品的顏色比標準的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度高, 樣品的顏色比標準的顏色深則三聚氰胺的濃度比標準樣的濃度低。

2.    定量分析需要繪製以標準樣的吸光率為X軸,以標準樣的濃度的半對數為Y軸的曲線圖.依據標準樣吸光率的點畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率範圍應比標準樣的最底範圍高,比最高範圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大於500ppb或小於20ppb。

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