1 簡介

本產品是用競爭酶聯免疫反應原理來檢測生物樣本中的氯黴素含量。本試劑盒包含檢測所需的所有試劑——包括標準品。

檢測數量：96孔（包括標準品）

檢測時間：20分鍾

 

2 應用範圍

本試劑盒可用於檢測奶、組織（肌肉
、肝髒
、腎髒、蝦類
、蟹類、魚類）
、尿液、血液和飼料樣本中的氯黴素。

 

3 原理

反應在包被了氯黴素抗體的固相微孔板上進行。標準品、樣(yang)品(pin)和(he)酶(mei)標(biao)物(wu)加(jia)入(ru)到(dao)微(wei)孔(kong)中(zhong)，第(di)一(yi)次(ci)溫(wen)浴(yu)時(shi)，標(biao)準(zhun)品(pin)或(huo)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)遊(you)離(li)氯(lv)黴(mei)素(su)分(fen)子(zi)與(yu)酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)氯(lv)黴(mei)素(su)分(fen)子(zi)競(jing)爭(zheng)結(jie)合(he)吸(xi)附(fu)在(zai)固(gu)相(xiang)上(shang)的(de)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)位(wei)點(dian)。沒(mei)有(you)結(jie)合(he)的(de)分(fen)子(zi)被(bei)清(qing)洗(xi)除(chu)去(qu)
，通(tong)過(guo)加(jia)入(ru)顯(xian)色(se)底(di)物(wu)來(lai)確(que)定(ding)已(yi)經(jing)結(jie)合(he)的(de)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)，酶(mei)使(shi)得(de)無(wu)色(se)的(de)底(di)物(wu)轉(zhuan)變(bian)成(cheng)蘭(lan)色(se)，加(jia)入(ru)反(fan)應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)使(shi)得(de)蘭(lan)色(se)變(bian)為(wei)黃(huang)色(se)，用(yong)酶(mei)標(biao)儀(yi)在(zai)450nm處讀出吸光度。顏色的深淺可以轉換為樣品中氯黴素的不同濃度。

 

4 試劑組成

微孔板：96孔（12×8，可分拆）直接包被氯黴素抗體

標準品：0.025ng/mL; 0.1ng/mL; 0.25ng/mL; 1ng/mL; 4ng/mL; 1ml含0.1ug/ml濃度的氯黴素標準品1瓶

酶標物凍幹粉：玻璃瓶 1瓶

酶標物稀釋液：13ml塑料瓶1瓶（棕色）

顯色劑：13ml 塑料瓶1瓶（棕色）

終止液：13ml塑料瓶1瓶（白色）

清洗液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）

氯黴素樣品稀釋液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）

 

5 需要但未提供的材料

樣品前處理需要：

 － 甲醇、乙酸乙酯、正己烷
、異辛烷
、三氯甲烷

 － 組織勻漿機、天平、水浴鍋
，搖床（振蕩器）

 － 離心機
，氮吹儀
，混合振蕩器

檢測中需要：

－ 20～200ul移液槍和槍頭

－ 50～200ul多通道移液槍和槍頭

－ 配備450nm濾光片的酶標儀

－ 擠瓶

 

6 注意事項

－ 終止液含有硫酸，注意不要接觸皮膚

－ 顯色劑有毒，不要接觸皮膚；如果接觸請用水衝洗

－ 不要在有效期過後使用試劑

－ 不同批號的試劑不要混用

 

7 保存

－ 2～8℃保存，切勿冰凍

－ 沒有使用的微孔條請務必用幹燥劑保存在密封的袋子中

 

8 樣品前處理

8.1尿樣

8.1.1直接法

— 200µl尿樣與800µl氯黴素樣品稀釋液混合

— 混合物在2000g，離心10min

—     取50µl上清用於檢測

—     檢測最終結果應乘以稀釋倍數5

8.1.2抽提法

建議對“深色/不潔”尿樣采用

— 1ml尿液用1M乙酸調PH值到4.8

— 加入25µl蝸牛液（Helix pomatia juice）
，37℃下溫浴過夜或55℃下溫浴2小時。

— 冷卻至室溫

，並將PH值調節到7±0.5

— 加入2ml乙酸乙酯，混合1min。靜置5-10 min分層。

— 將1ml上層液（乙酸乙酯層）轉移到幹淨的試管中。

— 50℃，氮吹儀吹幹

— 用200氯黴素樣品稀釋液溶解
，混勻

— 取50µl用於檢測

—     檢測最終結果應乘以稀釋倍數0.4

8.2 血清/血漿樣品

— 1ml血清/血漿加入2ml乙酸乙酯混合1min，靜置5-10min，令其發生相分離

—     取1ml乙酸乙酯於一新的試管

—     50℃

，氮吹儀吹幹

— 加入500µl氯黴素樣品稀釋液混合均勻

—     取50µl用於檢測

—     檢測最終結果應乘以稀釋倍數1

8.3 奶

8.3.1

— 2000g

，離心15min，去除上層脂肪

— 取50ul用於檢測。

注意：檢測酸奶時，應調樣品PH值至中性。

8.3.2

— 取5ml牛奶樣品於一試管中

— 2000g，離心15min，去除上層脂肪

—     取2.5ml脫脂奶於一新的試管

—     加入5ml乙酸乙酯，渦旋混合1min，靜置10min

—     取4ml乙酸乙酯上層到幹淨玻璃管中

—     50℃，氮吹儀吹幹

— 用200µl氯黴素樣品稀釋液溶解

— 取50µl用於檢測

— 計算最終結果應乘以稀釋倍數0.1

（脫脂奶粉處理方法：將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉，再按上述步驟操作）

8.4蛋類樣品

—     取1g勻漿全蛋

—     加入6ml乙酸乙酯渦旋混合1min

— 2000g離心10min

—     取3ml上層乙酸乙酯於一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹幹

— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入500µl氯黴素樣品稀釋液，渦旋混合1min

— 2000g，離心10min

—     取50µl上層用於檢測

—     計算最終結果應乘以稀釋倍數1

注意：若上層乳化，可將試管置於80℃水浴約5min

，並再次進行離心。

8.5 組織樣品（肉類、肝髒、蝦類、蟹類、魚類）

方法一：

— 取3g勻漿樣品

— 加入6ml乙酸乙酯渦旋混合，振搖10min

— 2000g
，離心10min

—     取4ml乙酸乙酯上層於一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹幹

— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入1ml氯黴素樣品稀釋液，渦旋混合1min

— 2000g，離心10min

—     吸取50µl上層用於檢測。

—     計算最終結果應乘以稀釋倍數0.5

注意：若上層乳化，可將試管置於水浴（80℃ ）約5min，並再次進行離心。

另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心後應完全去除上層正己烷，移取50µl下層用於檢測。

方法二：用於蝦、魚
、蟹類的大樣品量處理

— 10g勻漿化樣品與20ml乙酸乙酯混合10min

— 2000g，離心10min（或用濾紙過濾）

—     取10ml乙酸乙酯層於一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹幹

— 加入2ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或2ml正己烷

，參見方法一），並加入1ml氯黴素樣品稀釋液
，充分混合。若發現乳化，可將試管在水浴（80℃）中加熱（5min）。並將此溶液在2000g下離心10min。

— 利用巴斯德滴管轉移上層清夜（若用正己烷，清夜則在下層）於清潔玻璃管中。

— 再加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或1ml正己烷）。混合上述溶液並離心分離如上。

— 吸取50µl上層用於檢測（若用正己烷，清液則在下層）。

注：檢測最終結果乘以稀釋倍數0.2

8.6 蜂產品

8.6.1蜂蜜樣品

— 3g樣品與3ml蒸餾水充分混合

— 加入6ml乙酸乙酯充分振蕩混合10min

— 2000g離心10min

—     轉移4ml上層乙酸乙酯於一新的試管

—     50℃，氮吹儀吹幹

— 殘留物充分溶解於1ml氯黴素樣品稀釋液

— 吸取50µl用於檢測

對於不純淨的蜂蜜應進行脫脂處理：

— 將氮流蒸發後的殘留物溶於1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）
，加入1ml樣品稀釋液

— 渦旋混合1min，2000g，離心10min

注意：若上層乳化，可將試管置於水浴（80℃）約5min

，並再次進行離心。

—     吸取50µl上層用於檢測。

—     檢測最終結果應乘以稀釋倍數0.5。

另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心後應完全去除上層正己烷層，移取50µl下層用於檢測。

8.6.2蜂王漿

— 1g蜂王漿與4ml抽提緩衝液（10.1g 1-庚烷磺酸，11.4g Na3PO4.12H2O。溶於1000ml蒸餾水中，用H3PO4調整pH2.0）混合30min

— 3000g離心10min

— 取2.5ml上清液用Oasis HLB柱（60mg Waters公司WAT094226）按以下固相抽提步驟純化：

— 依次用1ml100％甲醇和1ml蒸餾水活化該柱（樣品過柱前柱不能過幹
，否則需要重複活化）

— 將上述2.5ml上清液真空抽濾過柱

— 用3ml蒸餾水及3ml 50％（1：1

；V：V）甲醇洗柱
，真空幹柱

— 用1ml100％甲醇洗脫
，用幹淨玻璃管收集洗脫液

— 洗脫液在溫和氮流下蒸發甲醇

— 樣品殘留物溶入0.5ml氯黴素樣品稀釋液中

—     吸取50µl用於檢測

—     檢測最終結果乘以稀釋倍數1

注意：若無真空泵，可使用正壓洗滌柱子；

8.7 飼料樣品

— 5g樣品與20ml蒸餾水混勻

— 取5ml混合物到幹淨玻管中，加入10ml乙酸乙酯混合2min

— 2000g離心10min

— 轉移5ml乙酸乙酯（上層）到幹淨玻管中，50℃溫和的氮流下蒸發

— 殘留物溶於0.5ml異辛烷/三氯甲烷（2：3
，V/V）
，加入0.5ml氯黴素樣品稀釋液，混合液渦旋1min
，

—     2000g離心10min

—     取50µl上層用於檢測

—     檢測最終結果應乘以稀釋倍數1

注：若發現乳化，可將試管在水浴（80℃）中加熱（5min），並將此溶液再次離心，吸取50µl上層清液檢測

注意：本說明書提供的樣品前處理方法僅作參考，實驗人員可以根據自己的經驗作改善以提高檢測準確度。

 

9 工作液準備

為了避免汙染，建議在配置標準品不要與試劑檢測工作在同一室內進行

，並使用不同的移液槍。

注意：整套標準品應該在每個檢測實驗前臨時配置！！

氯黴素樣品稀釋液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9）
，注意：如果出現結晶
，請將溶液放於室溫下搖動，重新完全溶解。

標準品配製：使用已經稀釋的氯黴素樣品稀釋液。

-         10ng/ml濃度：100ng/ml原始濃度溶液100ul +稀釋液900ul（1:10）

-         4ng/ml濃度：10ng/ml溶液400ul +稀釋液600ul（1:2.5）

-         1ng/ml濃度：4ng/ml 溶液 200ul +稀釋液600ul（1:4）

-         0.25ng/ml濃度：1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）

-         0.1ng/ml濃度：0.25ng/ml溶液400ul+稀釋液600ul（1:2.5）

-         0.025ng/ml濃度：0.1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）

此氯黴素樣品稀釋液也應當用於B0孔。

酶標物：實驗前用12mL酶標物稀釋液溶解
，並充分混勻。靜置8小時（或過夜，但至少4小時），切勿渦旋混勻。

清洗液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9）。注意：如果出現結晶
，請將溶液放於室溫下搖動，重新完全溶解。

顯色劑：備用。

終止液：備用。

 

10 分析步驟

10.1 注意事項

－ 使用前請將試劑盒恢複到室溫（20～25℃）

－ 使用後請立即將所有試劑放回2～8℃

－ 請不要改動分析步驟
，尤其：

－ 不同的樣品和標準品使用一次性槍頭以避免交叉汙染

－ 不要讓槍頭和微孔中的溶液或內避接觸

10.2 檢測程序

1. 用記錄表記錄B0，標準品和樣品的位置
，要求做雙孔平行。

2. 加入標準品和樣品：

 －50ul氯黴素樣品稀釋液加入B0孔

 －標準品或樣品50ul加入微孔

3. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul酶標物溶液。

4. 晃動酶標板。

5. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。溫浴過程中建議晃動酶標板2～3次。

6. 清洗步驟：

 － 倒去微孔中的溶液

 － 用擠瓶將所有微孔加滿清洗液，然後倒去

 － 在吸水紙上拍打除去殘留溶液

 重複清洗四遍。

 不要讓微孔幹燥。

7. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul反應液。

8. 輕輕晃動酶標板。

9. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。

10. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul的終止液。

11. 輕輕晃動酶標板。

12. 在450nm下檢測吸光度
，結果在10min內讀取最佳，30min內有效。

 

11 結果計算

－ 計算最大結合率（B0）、標準品和樣品的平均吸光度

－ 根據以下公式來計算標準品和樣品的結合率

－ 根據標準品的B/B0值在半對數曲線中畫出標準曲線

－ 獲得樣品的B/B0值後在標準曲線上可以得到對應的氯黴素濃度值ppb（ug/kg或ug/L）
，實際濃度還要乘上稀釋倍數。

 

12檢測下限

組織          0.1ng/g

尿液和奶樣    0.2ng/mL

 

13 特異性