一、概要
用來檢測呋喃它酮代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS，酶聯免疫方法結合了色譜技術


，采用AMOZ衍(yan)生(sheng)物(wu)的(de)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)，具(ju)有(you)很(hen)高(gao)的(de)精(jing)確(que)度(du)和(he)靈(ling)敏(min)度(du)，較(jiao)低(di)的(de)操(cao)作(zuo)技(ji)術(shu)要(yao)求(qiu)和(he)短(duan)暫(zan)的(de)檢(jian)測(ce)時(shi)間(jian)
，檢(jian)測(ce)樣(yang)本(ben)量(liang)大(da)等(deng)特(te)點(dian)在(zai)檢(jian)測(ce)中(zhong)很(hen)好(hao)的(de)表(biao)現(xian)出(chu)來(lai)。

二、試驗原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物AMOZ經衍生化後和酶標板微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃它酮代謝物的衍生物抗體
，加入酶標二抗後，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AMOZ代謝物的含量成負相關
，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中呋喃它酮代謝物的殘留量。

三、適用範圍
   可定性
、定量檢測動物組織（雞
、豬、牛、魚、蝦等）、牛奶和蜂蜜中呋喃它酮代謝物的殘留量。

四、交叉反應率
呋喃它酮代謝物………………………………………  100%
呋喃唑酮代謝物…………………………………小於 0.1%
呋喃妥因代謝物…………………………………小於 0.1%
硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小於0.1%
呋喃唑酮………………………………………………小於1%
呋喃它酮………………………………………………11.1%
呋喃妥因………………………………………………小於1%
呋喃西林…………………………………………小於1%

五
、使用單位需自備的設備及試劑
設備：
┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm
┅┅旋轉蒸發儀/氮氣吹幹裝置
┅┅均質器
┅┅振蕩器
┅┅離心機
┅┅天平：感量0.01g
┅┅刻度移液管：10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶：10ml、100ml、1L
┅┅玻璃試管：10ml
┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、10ml、50ml
┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
試劑：
┅┅乙酸乙酯(分析純)
┅┅正己烷（或正庚烷）(分析純)
┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶樣用）
┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶樣用）
┅┅濃鹽酸
┅┅氫氧化鈉(分析純)
┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標板×1塊 （包被有偶聯抗原）
2、標準液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb，0.1ppb，0.3ppb

，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb
3、高濃度標準品：（1ml/瓶） 100ppb
4、酶標二抗         12ml …………………… 紅色帽
5、抗體工作液       7ml …………………… 綠色帽
6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
8

、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
9
、20×濃縮洗滌液     40ml……………………… 透明帽
10、2×濃縮複溶液      50ml……………………… 藍色帽
11、2-硝基苯甲醛      15.1mg…………………… 黑色帽

七

、溶液的配製
配液1：衍生化試劑 
          向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。
配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液
            稱取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。
配液3: C液（供奶樣用）：
0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液
             稱取10.7g 二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml
      D液（供奶樣用）：
1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液
             稱取28.8 g七水合硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml。
配液4: 1M鹽酸溶液      
             量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。
配液5: 1M 氫氧化鈉溶液
             稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
配液6: 複溶工作液
用去離子水將2×濃縮複溶液按1：1體積比進行稀釋（1份2×濃縮複溶液+1份去離子水）用於提取樣本的複溶，複溶工作液在4℃環境可保存一個月。
配液7: 洗滌液工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用於酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
   （b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否幹淨，必須使用潔淨實驗器具
，以避免汙染幹擾實驗結果
（c）衍生化試劑可於2-8℃保存半年。
（d）磷酸氫二鉀溶液可於2-8℃保存三個月。
（e）鹽酸溶液可於室溫保存三個月。
（f）氫氧化鈉溶液可於室溫保存三個月。
（g）未處理的樣本冷凍保存。
（h）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時。
（一）肌肉、肝髒、水產（魚蝦等）組織前處理方法
┅┅用均質器均質樣本；
┅┅接(四)的描述方法。
注：樣本應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存
（二）牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min
，吸除上層脂肪；
┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中；
┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液3）；
┅┅用振蕩器充分混合樣本後，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機
，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然後離心；
┅┅接(四)的描述方法
（三）蜂蜜前處理方法
┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中
；
┅┅用4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；
┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；
┅┅接(四)第二步描述方法（標 * 處）。
（四）接上麵的方法
┅┅稱取1.0±0.05g均質後的組織樣本（肝樣/肉樣）、製備好的牛奶樣本上清液1.1ml（相當於1ml的奶樣）
，分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1）
，用振蕩器充分振蕩2min
；
*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；
┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）
、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
┅┅3000g以上
，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml幹燥的玻璃試管中
，於50～60℃氮氣流下吹幹；
┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s
，再加入1ml複溶工作液（見配液6）
，用渦旋儀渦動1min充分混勻；
┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；
┅┅除去上層有機相，取下層水相50µl用於分析。

九、檢測步驟
測定前應須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之後立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環境中取出
，置於室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋


，保存於2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4
、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號
，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣本：加標準品/樣本50ml到對應的微孔中，然後加入抗體工作液50ml/孔


，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25℃避光環境中反應30min。
6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液（見配液7）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s
，用吸水紙拍幹（拍幹後未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7、加酶標二抗：加入酶標二抗100ml/孔
，輕輕振蕩混勻
，用蓋板膜蓋板後置25℃避光環境中反應30min，取出重複洗板步驟6。
8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25℃避光環境中反應15min（見注意事項8）。
9
、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。

十
、結果判定
    結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法
，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃它酮代謝物的含量成負相關。
1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度範圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.301，樣本2的吸光度值為0.830，標準品吸光度值分別是： 0ppb為2.018；0.1ppb為1.475；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.472；2.7ppb為0.187； 8.1ppb為0.079。則樣本1的濃度範圍是0.9ppb-2.7ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃它酮代謝物殘留的濃度範圍
；樣本2的濃度範圍是0.3ppb-0.9ppb
，再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃它酮代謝物殘留的濃度範圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ B ×100%
 B0 
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪製與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃它酮代謝物標準品濃度（ppb）的(de)半(ban)對(dui)數(shu)為(wei)橫(heng)坐(zuo)標(biao)
，繪(hui)製(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)圖(tu)。將(jiang)樣(yang)本(ben)的(de)百(bai)分(fen)吸(xi)光(guang)率(lv)代(dai)入(ru)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)中(zhong)

，從(cong)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)讀(du)出(chu)樣(yang)本(ben)所(suo)對(dui)應(ying)的(de)濃(nong)度(du)，乘(cheng)以(yi)其(qi)對(dui)應(ying)的(de)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數(shu)即(ji)為(wei)樣(yang)本(ben)中(zhong)呋(fu)喃(nan)它(ta)酮(tong)代(dai)謝(xie)物(wu)的(de)實(shi)際(ji)濃(nong)度(du)。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便於大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
樣本稀釋倍數
水產（魚蝦等）
、肌肉、肝髒樣品稀釋倍數：2
奶樣樣品稀釋倍數：2
蜂蜜樣品稀釋倍數：2

十一
、檢測方法靈敏度、準確度、精密度
試劑盒靈敏度：0.1ppb
樣本最低檢測限：
因組織樣品存在一定的幹擾
，檢測下限為0.3ppb
奶樣、蜂蜜………………………………………………0.2ppb
準確度：
水產

、雞肉、肝髒組織………………………………  75±15%           蜂蜜 ……………………………………………… 90±15%
奶樣…………………………………………………  90±10%
精密度：
試劑盒的變異係數均小於10%

十二、注意事項
1、室溫低於20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔幹燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重複性不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應終止液為2M硫酸
，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低
；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件
保存試劑盒於2-8℃
，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感
，因此要避免直接暴露在光線下。
7
、試劑變質的跡象
發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小於0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8
、在加入底物液A和底物液B液後
，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。
9、該試劑盒最佳反應溫度為25℃

，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

十三、貯藏條件及保存期
     貯藏條件：保存試劑盒於2~8℃。
保存期：該產品有效期為12個月。

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