【試劑盒組成】
25 管 擴增反應試劑球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 擴增反應試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control; -20℃ 保存)

【保存條件】
試劑球需置幹燥劑中保存在4℃，已融解的試劑球則需保存在零下20℃。其他試劑亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各試劑並充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴增反應試劑。

【操作程序】
1 樣本采集

、存放及運輸
1.1 樣本采集：
所用取樣器材必須經高壓或幹熱滅菌。
若樣品為活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：quyanhoushizishijiangshizishenruhoutoukoujishangelielaihuiguajiciquyanhoufenmiye，quxiezhiqiangshizishijiangshizishenruxiezhiqiangzhuanyiquanzhanqufenbian。ranhoujiangshiziyiqifangrushengyou2ml PBS（含抗菌素）的試管
，充分洗滌拭子，然後在管壁擠幹液體，轉入無菌離心管中備用。
若樣品為新鮮肌肉或髒器，取待檢樣品2g於已洗淨


、滅菌並烘幹的研缽中充分研磨，加10ml PBS混勻
，取上清轉入無菌離心管中備用。為使樣品的代表性更強，也可取50克肉樣，加入50ml無菌的PBS液，用Bagmixer均質器處理後，取上清備用。
若樣品為血清、血漿或冷凍組織滲出液
，則直接取用。
1.2 存放：
分離後的樣本在2℃—8℃條件下保存應不超過24hr

； -70℃以下可長期保存
，但應避免反複凍融（最多凍融3次）。
1.3 運輸：
采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。
2 樣本處理：
2.1  取n個1.5ml滅菌離心管（n = 樣本數+ 1管陰性對照+ 1管陽性對照），作好標記。
2.2  首先加入600ul裂解液（裂解液即提取液，有很強的腐蝕性，切勿沾到皮膚或衣物，否則立即用大量清水衝洗並擦幹），然後分別加入待測樣本
、陰性對照、陽性對照各200ul（一份樣本換用一個吸頭）；再加入200ul氯仿
，混勻器上振蕩混勻5sec（不宜過於強烈，以免產生乳化層，也可用手顛倒混勻）。
2.3 於12,000g離心15min（如有條件，於4℃進行離心）。
2.4  取與步驟2.1.1中相同數量的1.5ml滅菌離心管，加入400ul異丙醇（－20℃預冷）
，作好標記。吸取步驟2.1.3各管中的上清液相轉移至相應的管中（上清液應至少吸取500ul
，注意不要吸出中間層
，該層富含DNA和蛋白質），顛倒混勻。
2.5  12,000g離心15min
，（注意固定離心管方向
，即將離心管開口朝離心機轉軸方向放置）。輕輕倒去上清
，倒置於吸水紙上，沾幹液體（不同樣品應在吸水紙不同地方沾幹）
；加入600ul 75%乙醇（－20℃預冷）
，顛倒洗滌。
2.6  12,000g離心10min
，（注意固定離心管方向
，即將離心管開口朝離心機轉軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置於吸水紙上
，盡量沾幹液體（不同樣品應在吸水紙不同地方沾幹）。
2.7  4,000g離心10sec（注意固定離心管方向，即將離心管開口朝離心機轉軸方向放置）將管壁上的殘餘液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸幹（一份樣本換用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉澱一麵），室溫幹燥5-10min（不宜過於幹燥，以免RNA不溶）。
2.8  加入11ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000g離心5sec，冰上保存備用（注意：此時的RNA最易受RNA酶降解，請在2小時內進行PCR擴增）。

3 擴增反應試劑的準備：
3.1 計算所需的反應數量 (n)
3.2 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3.3 每個試劑球需要 40 μl 試劑球溶液

3.4 在冰上溶解試劑，並輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)

4 反應的準備
4.1 實驗中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設置陽性和陰性（水）對照
4.2 按照下表準備擴增反應試劑：
反應組分--每個反應體積
擴增反應試劑 20 μl
樣品RNA 5 μl
總體積 25 μl
注意:實驗時 RNA 應放在冰上
，陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。建議PCR 過程中檢測樣本設置重複，以便得到可靠的實驗結果。為了驗證陰性實驗結果不是由於樣本中存有PCR 抑製物而導致PCR 呈陰性反應，我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照(spiking control)
，同時進行PCR 反應。
PCR 循環:
1 個循環  42℃ 30 分鍾
95℃ 10 分鍾
40 個循環 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒

5 實驗數據分析
PCR 的產物需要通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。
產物長度 : 246 bp
Spiking 對照陰性的實驗結果有幾個可能性： 樣本中不存在目的片段；樣本中目的片段的量低於檢測值；
【樣本中存有 PCR 抑製物】
試劑盒中設計spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發生PCR 抑製。如果樣本中加了陽性對照以後得出陰性結果，說明樣本中存在PCR 抑製物，那幺此次陰性的實驗結果就不能作為正確的結果，需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴增。

備注：
對於禽流感檢測樣本的獲得和前處理，可以參照國家標準“高致病性禽流感診斷技術（GB/T 18936-2003）”推薦的方法進行
，具體為：
【病料的采集】死禽采集氣管、脾
、肺
、肝

、腎和腦等組織樣品
，進行分別處理或者同時處理；活禽病料應包括氣管或泄殖腔拭子，尤其以采集氣管拭子更好
；小珍禽用拭子取樣易造成損傷，可采集新鮮新鮮糞便。

【病料的保存】病料應放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩衝液（PBS）內（無PBS可用25％～50％的甘油鹽水）。抗生素的選擇視當地情況而定，組織和氣管拭子懸液中應含有青黴素（2000IU/ml）
、鏈黴素（2mg/ml）、慶大黴素（50µg/ml）和製黴菌素（1000IU/ml）
，但糞便和泄殖腔拭子所有的抗生素濃度應提高5倍
，加入抗生素後pH值應調至7.0～7.4。在室溫放置1h～2h後樣品應盡快處理，沒有條件的可在4℃存放幾天
，也可於低溫條件下保存（-70℃貯存最好）。

【病料的處理】將棉拭子充分撚動、擰幹後棄去拭子；糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10％～20％（g/ml）的懸液，樣品液經1000r/min離心10min，取上清液作為實驗材料。

【病料保存樣本保存和運送的一般原則是什麼】
一般性原則：采集和運輸：
標本采集用材料，如棉簽和拭子都應一次性使用，所使用的抗腐劑和抗凝劑不應對樣本和擴增反應有降解或抑製作用。
對於RNA樣本
，要特別注意混入操作人員的毛發、表皮細胞和痰液。
對於DNA樣本的運送：可在室溫下運送，建議在8小時內完成
，對RNA
，10分鍾內的運輸可在室溫進行，超過此時間
，必須加冰運輸，既便低溫，一般亦不得超過4小時。
標本的保存：對DNA：2℃－8℃可穩定放置3天，RNA一律－20℃保存。
主要的擴增反應抑製物質：血樣中用於抗凝的肝素，可以枸櫞酸鈉或EDTA-K3替代
；血紅蛋白、乳鐵蛋白
【口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣品如何保存】
口腔棉簽拭子和瀉殖腔樣本一般不單獨保存
，在取樣後，應盡快將其放入含PBS緩衝液（有時要加入抗生素）的離心管充分撚動
，擰幹後立即進行處理和使用，不立即使用時，推薦-70℃低溫保存。如果暫時不處理
，也可將拭子留於離心管中低溫保存。

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