用於分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時,凝膠板浸泡在電極緩衝液下1-2mm,故(gu)又(you)稱(cheng)為(wei)潛(qian)水(shui)式(shi)。目(mu)前(qian)更(geng)多(duo)用(yong)的(de)是(shi)後(hou)者(zhe),因(yin)為(wei)它(ta)製(zhi)膠(jiao)和(he)加(jia)樣(yang)比(bi)較(jiao)方(fang)便(bian),電(dian)泳(yong)槽(cao)簡(jian)單(dan),易(yi)於(yu)製(zhi)作(zuo),又(you)可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)需(xu)要(yao)製(zhi)備(bei)不(bu)同(tong)規(gui)格(ge)的(de)凝(ning)膠(jiao)板(ban),節(jie)約(yue)凝(ning)膠(jiao),因(yin)而(er)較(jiao)受(shou)歡(huan)迎(ying)。
② 緩衝液係統
缺少離子時,電流太小,DNA遷移慢;相反,高離子強度的緩衝液由於電流太大會大量產熱,嚴重時,會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩衝液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等,濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩衝液一般都配製成濃的貯備液,臨用時稀釋到所需倍數。
TAE緩衝能力較低,後兩者有足夠高的緩衝能力,因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉澱,為避免此缺點,室溫下貯存5×溶液,用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩衝能力。
③ 凝膠的製備
以稀釋的電極緩衝液為溶劑,用沸水浴或微波爐配製一定濃度的溶膠,灌入水平膠框或垂直膠膜,插入梳子,自然冷卻。
④ 樣品配製與加樣
DNA樣品用適量Tris-EDTA緩衝液溶解,緩衝液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。
⑤ 電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強度增加時,較大的DNA段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高,電泳分辨率反而下降,為了獲得電泳分離DNA段的zui大分辨率,電場強度不宜高於5V/cm。
電泳係統的溫度對於DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳,隻有當凝膠濃度低於0.5%時,為增加凝膠硬度,可在4℃進行電泳。
⑥ 染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠(EB)染色,在紫外光下觀察DNA條帶,用紫外分析儀拍照,或用凝膠成像係統輸出照片,並進行有關的數據分析。
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