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以下是其詳細的工作原理，分為三個核心步驟：
1. 樣品分區
這是數字PCR最核心的環節。
目的：將一個標準的PCR反應體係（包含待檢測的DNA模板、引物、熒光探針等）隨機分配到成千上萬個獨立、微小的反應單元中。
方式：
（1）微滴式：通過微流控或油包水技術，將樣品生成數萬個甚至數百萬個納升級別的微滴（如Bio-Rad的QX係列）。
（2）芯片式：將樣品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio係列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片進行物理隔離。
（4）關鍵結果：分區後，每個微反應單元要麼含有0個目標分子，要麼含有1個（或極少數情況多個）目標分子。這個過程遵循泊鬆分布的統計學原理。
2. PCR擴增與終點檢測
分區完成後，這些反應單元（微滴或微孔）會在常規的熱循環儀上進行PCR擴增。
擴增：每個微反應單元獨立進行PCR反應。如果某個單元內包含至少一個目標DNA分子，擴增後該單元的熒光信號會顯著增強（陽性）；如果單元內沒有目標分子，則沒有熒光信號（陰性）。
檢測：擴增結束後，儀器會逐個讀取每個反應單元的熒光信號。這個過程就像數數一樣，記錄下哪些孔/微滴亮了（陽性，1），哪些沒亮（陰性，0）。
3. 絕對定量分析
這是將熒光信號轉化為精確數據的步驟。
計數：儀器統計陽性單元的數量（即發生了擴增的單元）和陰性單元的數量（未發生擴增的單元）。
泊鬆校正：理(li)論(lun)上(shang)，我(wo)們(men)希(xi)望(wang)在(zai)分(fen)區(qu)時(shi)每(mei)個(ge)單(dan)元(yuan)最(zui)多(duo)隻(zhi)有(you)一(yi)個(ge)分(fen)子(zi)。但(dan)由(you)於(yu)隨(sui)機(ji)分(fen)布(bu)，有(you)可(ke)能(neng)出(chu)現(xian)兩(liang)個(ge)或(huo)多(duo)個(ge)目(mu)標(biao)分(fen)子(zi)進(jin)入(ru)同(tong)一(yi)個(ge)單(dan)元(yuan)的(de)情(qing)況(kuang)。例(li)如(ru)，如(ru)果(guo)10000個單元中有400個是陽性，你不能簡單地認為隻有400個分子，因為那400個陽性單元中可能有些單元含有多個分子。因此，需要利用泊鬆分布公式進行校正：通過陽性單元的比例（即陽性單元數/總有效單元數），計算出樣本中目標DNA分子的絕對起始拷貝數或濃度。
結果輸出：直接輸出拷貝數/µL（微升）或copies/reaction（拷貝/反應），無需依賴標準曲線。
與傳統qPCR（實時熒光定量PCR）的對比：
| 特性 | 數字PCR （dPCR） | 實時熒光定量PCR （qPCR） |
| 原理 | 無限稀釋 + 終點計數 | 擴增曲線 + Ct值（循環閾值） |
| 定量方式 | 絕對定量（直接計數） | 相對定量（依賴標準曲線） |
| 依賴標準品 | 不需要 | 必須依賴標準品或內參基因 |
| 靈敏度 | 極高（可檢測稀有突變，1/100000） | 較高 |
| 主要優勢 | 不受擴增效率影響，高精度，抗抑製能力強 | 動態範圍寬，成本較低，操作簡便 |
