適用範圍：

本思路僅適用於反向色譜法分析離子化合物方法開發中流動相pH的確定。

 

 

1.考察離子化合物的pKa值

在反相色譜分析中通常不要求化合物精確的pKa值，我們可以通過查閱文獻以或者根據化合物的結構按照下圖中列出的主要酸堿官能團在水溶液的pKa值進行推測。

 

 

注意：按照上表中官能團進行估算時分子中相鄰基團的不同會導致pKa出現1-2個單位的差異。對於酸性化合物，當含有吸電子基團時會導致酸性增強，pKa值相應降低
；對於堿性化合物，當含有吸電子基團時會導致堿性降低
，pKa值相應降低。

 

2.根據化合物pKa值推測流動相相應使用的pH

 

先看下流動相pH對酸堿化合物的影響：

 

1.流動相pH對不同pKa化合物的保留時間的影響

 

 

請仔細觀察上圖，通過該圖我們可以獲得以下信息：

 

(1)調節流動相pH可改變離子化合物的保留

強酸及弱酸性化合物在酸性條件下會以分子形式存在，此時疏水性較高（極性大）在RPC的保留會較強。強堿及弱堿性化合物在堿性條件下多以分子形式存在
，此時疏水性較高（極性大）在RPC的保留會較強。而中性化合物的保留基本與pH沒有關係，不隨pH的改變發生保留時間的變動。因此我們在方法開發的時候可以通過改變流動相的pH進行改變化合物的保留時間

 

(2)在pH3-9範圍內微小的pH變化可能會引起保留時間的明顯變化，因此建議方法開發初始pH調節範圍在2～3
，這樣可以降低對pH略微變化的敏感性。

(3)如果是未知的化合物，調節pH值我們可以根據保留時間的變化推斷化合物的酸堿性
，比如保留時間隨著pH的增大而延長的樣品肯定是堿性化合物。

 

2.流動相pH對化合物峰型的影響

根據流動相pH對酸堿化合物的電離的影響，當化合物的pKa與流動相pH重合時會導致分子與離子形式共存，化合物的峰型不好。因此建議將pH控製在化合物的pKa±2的範圍以外，此時化合物99%基本是以分子或者離子形式存在
，峰型會更加的尖銳。

 

3.流動相pH對化合物的選擇性的影響

 

 

 

根據這幅圖，我們可以看出，當流動相的pH約等於化合物的pKa時，可以最大限度的調整化合物的保留時間。此時改變0.1個單位的pH可以使得保留因子k變化10%，可引起分離度±2.5個單位的變動。但此時需要進行精確控製流動相的pH，這要求把流動相pH控製在0.02個單位以內，在實驗室很難控製，重現性較差，成為分析的瓶頸。

 

但我們實驗時可以將pH範圍放寬，隻要將流動相pH控製在化合物pKa值±1.5個單位的範圍內（上圖所示的II範圍內）就可以對化合物保留行為產生比較明顯的影響
，此時進行分離選擇性較好。同時為了更好地控製保留行為的重現性，需要控製緩衝液的pH在±0.1個單位以內(當流動相pH控製範圍較窄時建議使用緩衝鹽的質量進行控製，比pH計進行控製效果更優)。

 

通過以上三點分析我們可以得出，待分析化合物的pKa與確定流動相的pH有很大的關係。主要依據化合物出峰時間
、化合物的峰型及所需要分離目標的化合物綜合考慮來確定流動相的pH。

 

可能有的同事會發現第二點和第三點是有些矛盾的
，這時候就需要對自己的實驗進行初步的探索
，看看是否pH值會對化合物的峰型產生影響（有的專家認為該觀點缺乏理論和實踐的支持）或者是否需要準確調節pH在化合物pKa±1.5範圍內進行提高選擇性。

 

筆者在做實驗時發現有的物質會因稀釋液pH使用不當產生峰分叉的現象，調節稀釋液的pH即可解決峰的分叉；有時流動相pH在化合物的pKa±2的範圍內時離子化合物並沒有出現峰分叉、峰型不好現象。

 

3.根據流動相pH值測定所需要的緩衝鹽

 

1.緩衝液選擇主要依據：

（1）緩衝溶液的pKa和緩衝容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

 

2.對以上三點進行說明

(1)一般緩衝溶液的pKa值與流動相的pH相等時緩衝能力最大，pKa與流動相的pH相差越大，緩衝液的緩衝能力越差。一般要求流動相的pH與緩衝液的pKa值不能超過±1.0個單位，當緩衝溶液濃度較高時可以放寬範圍到1.5個單位。常用的緩衝液的緩衝範圍見下圖：

 

 

 

緩衝溶液的濃度一般在5-50mmol，因過低導致緩衝能力不足（可通過調整進樣體積查看化合物峰型的變化
，如果出現拖尾或者前沿現象，說明緩衝溶液的能力不足）
；緩衝液濃度過大會導致與有機相混溶時鹽的析出

，對儀器、色譜柱都會產生損傷，而且使得基線不好。一般初始摸索方法時推薦使用25mmol。

 

（2）根據緩衝液溶解度：在酸性緩衝溶液中
，如磷酸鹽
，緩衝液溶解度順序：鈉鹽＜鉀鹽＜銨鹽；有研究發現，當pH=7時10mmol的磷酸鉀在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3時，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此測試通過使用容器將不同比例的混合溶劑進行混合，觀察大約30min，是否有沉澱產生，否則就要降低緩衝液的濃度或者有機相的含量，在梯度洗脫時尤為注意）。

 

（3）根據化合物的吸收波長：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸鹽緩衝液是不錯的選擇。而甲酸鹽和乙酸鹽緩衝液的範圍是2.5～6.0，適用於210納米或者更高吸收的檢測波長

 

3. 緩衝鹽的作用：

緩衝鹽的種類或者濃度對選擇性的改變會很小，隻是起到緩衝作用，提高化合物的保留時間的穩定性。

 

以上就是方法開發中流動相pH確定的主要基本思路。筆者在做實驗發現這些理論上的知識我們可能已經知道了，但是在運用到方法開發的時候並不是一帆風順的。比如說我們最近做的一個苯胺類化合物，推測其為堿性，想象中改變流動相的pH應(ying)該(gai)會(hui)發(fa)生(sheng)保(bao)留(liu)的(de)變(bian)化(hua)，但(dan)是(shi)我(wo)們(men)從(cong)酸(suan)性(xing)調(tiao)節(jie)到(dao)堿(jian)性(xing)該(gai)化(hua)合(he)物(wu)的(de)保(bao)留(liu)卻(que)沒(mei)有(you)變(bian)動(dong)，後(hou)來(lai)我(wo)們(men)分(fen)析(xi)可(ke)能(neng)是(shi)因(yin)該(gai)化(hua)合(he)物(wu)有(you)較(jiao)強(qiang)的(de)吸(xi)電(dian)子(zi)基(ji)團(tuan)導(dao)致(zhi)堿(jian)性(xing)降(jiang)低(di)變(bian)成(cheng)一(yi)個(ge)接(jie)近(jin)中(zhong)性(xing)的(de)物(wu)質(zhi)
，故保留時間不再受pH的影響。

 

筆者相信在方法開發時努力嚐試使用理論知識去指導實踐最終一定會取得較好的結果
，而且會事半功倍。有時候理論無法去指導實踐可能是因為我們的理論知識層麵還沒達到
，有些地方可能沒有注意到有其它條件的影響。但(dan)隻(zhi)要(yao)我(wo)們(men)一(yi)直(zhi)堅(jian)持(chi)使(shi)用(yong)知(zhi)識(shi)去(qu)指(zhi)導(dao)實(shi)踐(jian)
，通(tong)過(guo)實(shi)踐(jian)來(lai)驗(yan)證(zheng)所(suo)學(xue)的(de)知(zhi)識(shi)，反(fan)複(fu)的(de)相(xiang)融(rong)合(he)，不(bu)斷(duan)的(de)總(zong)結(jie)
，落(luo)實(shi)到(dao)書(shu)麵(mian)上(shang)，我(wo)們(men)在(zai)方(fang)法(fa)開(kai)發(fa)時(shi)一(yi)定(ding)會(hui)越(yue)來(lai)越(yue)順(shun)手(shou)。

 

參考文獻：原：Lloyd R.Snyder,Joseph J.Kirkland, John W.Doln，譯：陳曉明，唐雅妍。現代液相色譜技術導論（第三版）。