Western免疫印跡（Western Blot）是(shi)將(jiang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)轉(zhuan)移(yi)到(dao)膜(mo)上(shang)，然(ran)後(hou)利(li)用(yong)抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)。對(dui)已(yi)知(zhi)表(biao)達(da)蛋(dan)白(bai)，可(ke)用(yong)相(xiang)應(ying)抗(kang)體(ti)作(zuo)為(wei)一(yi)抗(kang)進(jin)行(xing)檢(jian)測(ce)，對(dui)新(xin)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達(da)產(chan)物(wu)，可(ke)通(tong)過(guo)融(rong)合(he)部(bu)分(fen)的(de)抗(kang)體(ti)檢(jian)測(ce)。 

一、原理 
與Southern或Northern雜交方法類似


，但Western 
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳

，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）shang


，guxiangzaitiyifeigongjiajianxingshixifudanbaizhi，qienengbaochidianyongfenlideduotaileixingjiqishengwuxuehuoxingbubian。yiguxiangzaitishangdedanbaizhihuoduotaizuoweikangyuan
，yuduiyingdekangtiqimianyifanying，zaiyumeihuotongweisubiaojidedierkangtiqifanying，jingguodiwuxiansehuofangshezixianyingyijiancedianyongfenlideteyixingmudejiyinbiaodadedanbaichengfen。gaijishuyeguangfanyingyongyujiancedanbaishuipingdebiaoda。  
 
二、分類 
western顯影的方法主要有以下幾種： 
1.放射自顯影 
2.底物化學發光ECL 
3.底物熒光ECF 
4.底物DAB顯色 
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。隻要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光
，可使膠片曝光
，就可洗出條帶。  

三、主要試劑 
1
、丙烯酰胺和N
，N’-亞甲雙丙烯酰胺
，應以溫熱(以利於溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配製含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g

，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g
，加H2O至100ml。)儲於棕色瓶
，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月
，隔幾個月須重新配製。如有沉澱，可以過濾。 
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS

，1mlH2O去離子水配製，室溫保存。 
3、分離膠緩衝液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。 
4、濃縮膠緩衝液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於40mlH2O中，用約48ml 1mol/L 
HCL調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。這兩種緩衝液必須使用Tris堿製備，再用HCL調節PH值
，而不用Tris.CL。 
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑製。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配製數ml，臨用前配製. 
6
、SDS-PAGE加樣緩衝液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩衝液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 
12.8ml
，巰基乙醇3.2ml

，0.05%溴酚藍1.6ml
，H2O 
32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合
，在沸水終煮3min混勻後再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。 
7
、Tris-甘氨酸電泳緩衝液:30.3gTris，188g甘氨酸
，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L 
Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩衝液。臨用前稀釋10倍。 
8、 轉移緩衝液：配製1L轉移緩衝液
，需稱取2.9g甘氨酸
、5.8gTris堿
、0.37g SDS

，並加入200ml甲醇，加水至總量1L。 
9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用後應予以廢棄。 
10
、 脫脂奶粉5%(w/v)。 
11
、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。 
12
、 Tris緩衝鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。 
13
、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。 
14
、 過氧化物酶標記的第二抗體。 
15、 NBT(溶於70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。 
16、 BCIP(溶於100%二甲基甲酰胺
，50mg/ml)。 
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。 
18、 100mmol/L NaCl。 
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。