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分光光度法是指應用分光光度計的分析方法，因其具有靈敏、準確、快kuai速su及ji選xuan擇ze性xing好hao等deng特te點dian被bei廣guang泛fan應ying用yong於yu實shi驗yan室shi的de元yuan素su分fen析xi，分fen光guang光guang度du計ji的de使shi用yong雖sui然ran簡jian單dan，但dan是shi其qi原yuan理li及ji一yi些xie基ji礎chu知zhi識shi想xiang必bi有you許xu多duo小xiao夥huo伴ban也ye是shi不bu了le解jie的de，今jin天tian小xiao編bian整zheng理li了le一yi些xie分fen享xiang給gei大da家jia，希xi望wang能neng對dui你ni有you所suo幫bang助zhu。
原理
1、物質對光的選擇性吸收
當光束照射到物質上時，光與物質發生相互作用，產生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
（1）溶液顏色的產生
dangyishubaiguangtongguomouyiyouserongyeshi，yixiebochangdeguangbeirongyexishou，lingyixiebochangdeguangzetouguorongye。tousheguanghuofansheguangcijirenyanshirengandaoyansedecunzai。renbazishennengganjiaodaodeguangdingyiweikejianguang。zaikejianguangqu，butongbochangdeguangchengxianbutongdeyanse，yincirongyedeyanseyoutousheguangdebochangsuojueding。tousheguangyuxishouguangkezuchengbaiguang，guchengzheliangzhongguanghuweibuseguang，liangzhongyansehuweibuse。
（2）光吸收的本質
當一束光照射到某物質或其溶液時，組成該物質的分子、原子或離子與光子發生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態（基態）躍遷到較高能態（激發態），這個作用稱為物質對光的吸收。
被激發的粒子約在10-8s後回到基態，並以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量hυ，與yu被bei照zhao射she物wu質zhi粒li子zi的de基ji態tai和he激ji發fa態tai能neng量liang之zhi差cha相xiang當dang時shi，才cai能neng發fa生sheng吸xi收shou。不bu同tong物wu質zhi微wei粒li由you於yu結jie構gou不bu同tong而er具ju有you不bu同tong的de量liang子zi化hua能neng級ji，其qi基ji態tai和he激ji發fa態tai能neng量liang差cha也ye不bu相xiang同tong。所suo以yi物wu質zhi對dui光guang的de吸xi收shou具ju有you選xuan擇ze性xing。
（3） 吸收曲線
xishouquxian，yechengweixishouguangpu，miaoshulewuzhiduibutongbochangdeguangdexishounengli。jiangbutongbochangdeguangtouguomouyigudingnongduhehoududeyouserongye，celiangmeiyibochangxiayouserongyeduiguangdexishouchengdu（即吸光度），然後以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪製的曲線即為吸收曲線。
不(bu)同(tong)濃(nong)度(du)的(de)同(tong)一(yi)物(wu)質(zhi)，在(zai)吸(xi)收(shou)峰(feng)附(fu)近(jin)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)隨(sui)著(zhe)濃(nong)度(du)增(zeng)加(jia)而(er)增(zeng)大(da)，但(dan)最(zui)大(da)吸(xi)收(shou)波(bo)長(chang)不(bu)變(bian)。若(ruo)在(zai)最(zui)大(da)吸(xi)收(shou)波(bo)長(chang)處(chu)測(ce)定(ding)吸(xi)光(guang)度(du)，則(ze)靈(ling)敏(min)度(du)最(zui)高(gao)。因(yin)此(ci)，吸(xi)收(shou)曲(qu)線(xian)是(shi)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法(fa)中(zhong)選(xuan)擇(ze)測(ce)定(ding)波(bo)長(chang)的(de)重(zhong)要(yao)依(yi)據(ju)。
2、光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過液層厚度為b的de有you色se溶rong液ye時shi，溶rong質zhi吸xi收shou了le光guang能neng，光guang的de強qiang度du就jiu要yao減jian弱ruo。溶rong液ye的de濃nong度du越yue大da，通tong過guo的de液ye層ceng厚hou度du越yue大da，入ru射she光guang越yue強qiang，則ze光guang被bei吸xi收shou的de越yue多duo，光guang強qiang度du的de減jian弱ruo也ye越yue顯xian著zhu。該gai定ding律lv是shi紫zi外wai可ke見jian分fen光guang光guang度du法fa等deng各ge類lei吸xi光guang光guang度du法fa定ding量liang分fen析xi的de依yi據ju，是shi由you實shi驗yan觀guan察cha得de到dao的de，不bu僅jin適shi用yong於yu溶rong液ye，也ye適shi用yong於yu其qi他ta均jun勻yun非fei散san射she的de吸xi光guang物wu質zhi。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光係數，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數，數值上等於濃度為1mol/L的吸光物質在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結果計算εshi，changyibeicewuzhidezongnongdudaitixiguangwuzhidenongdu，shijishangshibiaoguanmoerxiguangxishu。zaiduozufentixizhong，ruguogezhongxiguangwuzhizhijianmeiyouxianghuzuoyong，tixidezongxiguangdudengyugezufenxiguangduzhihe，jixiguangdujuyoujiahexing。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I0之比，即：
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
主要部件
盡管光度計種類型號繁多，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器、吸收池和檢測係統。
1、光源
在測量吸光度時，要求光源發出所需波長範圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，並在一定時間內能保持穩定。
在可見光區測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態時會發出波長在320~2500nm之間的連續光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定於電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩壓電源。
在紫外區測量時，常采用氫燈或氘燈產生波長在180~375nm之(zhi)間(jian)的(de)連(lian)續(xu)光(guang)譜(pu)作(zuo)為(wei)光(guang)源(yuan)。其(qi)理(li)想(xiang)光(guang)源(yuan)應(ying)具(ju)有(you)覆(fu)蓋(gai)整(zheng)個(ge)紫(zi)外(wai)可(ke)見(jian)光(guang)區(qu)的(de)連(lian)續(xu)輻(fu)射(she)，強(qiang)度(du)應(ying)比(bi)較(jiao)高(gao)，且(qie)隨(sui)波(bo)長(chang)變(bian)化(hua)能(neng)量(liang)變(bian)化(hua)不(bu)大(da)，但(dan)在(zai)實(shi)際(ji)上(shang)難(nan)以(yi)實(shi)現(xian)。氘(dao)燈(deng)輻(fu)射(she)強(qiang)度(du)比(bi)氫(qing)燈(deng)高(gao)2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高於氫燈，但欠穩定，波長範圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發光源。
2、單色器
單色器是將光源發射的複合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣（一般由透鏡或凹麵反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹麵鏡將分光後的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英製成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，隻能用於350-820nm波長的分析測定，在紫外區必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便於自動化，工作波段廣。
3、吸收池
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平麵。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由於吸收池厚度存在一定誤差，其材質對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應做配套性試驗，試驗後標記出放置方向。
紫外光區數值不跳為石英。
4、檢測係統
檢測係統包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉換設備，將光強度轉變為電信號顯示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用於初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。
光電倍增管利用二次電子發射來放大光電流，放大倍數可高達108倍，應用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由於全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內完成對190-800nm波長範圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控製儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。
測量條件的選擇
1、顯色反應及顯色條件的選擇
進行比色分析或光度分析時，首先要把待測組分轉變成有色化合物，然後進行比色或光度測定。
將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。（1）顯色反應的選擇
顯色反應分兩類，即絡合反應和氧化還原反應，絡合反應是最主要的顯色反應。
選用的原則是：
選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光係數ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標誌，因此應當選擇生成的有色物質的ε較大的顯色反應。一般來說，當ε為104-105時，可認為該反應靈敏度較高。
盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數幾個組分發生顯色反應。
顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質最大吸收波長之差稱為對比度，一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
反應生成的有色化合物組成恒定，化學性質穩定。
（2）顯色條件的選擇
吸(xi)光(guang)光(guang)度(du)法(fa)測(ce)定(ding)的(de)是(shi)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)達(da)到(dao)平(ping)衡(heng)後(hou)溶(rong)液(ye)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)，因(yin)此(ci)要(yao)得(de)到(dao)準(zhun)確(que)的(de)結(jie)果(guo)，必(bi)須(xu)從(cong)研(yan)究(jiu)平(ping)衡(heng)著(zhe)手(shou)，了(le)解(jie)影(ying)響(xiang)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)的(de)因(yin)素(su)，控(kong)製(zhi)適(shi)當(dang)的(de)條(tiao)件(jian)，使(shi)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)完(wan)全(quan)和(he)穩(wen)定(ding)。
根(gen)據(ju)溶(rong)液(ye)平(ping)衡(heng)原(yuan)理(li)，有(you)色(se)絡(luo)合(he)物(wu)的(de)穩(wen)定(ding)常(chang)數(shu)越(yue)大(da)，顯(xian)色(se)劑(ji)過(guo)量(liang)越(yue)多(duo)，越(yue)有(you)利(li)於(yu)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)形(xing)成(cheng)有(you)色(se)絡(luo)合(he)物(wu)。但(dan)是(shi)過(guo)量(liang)顯(xian)色(se)劑(ji)的(de)加(jia)入(ru)有(you)時(shi)會(hui)引(yin)起(qi)副(fu)反(fan)應(ying)，對(dui)測(ce)定(ding)反(fan)而(er)不(bu)利(li)。
酸suan度du對dui顯xian色se反fan應ying的de影ying響xiang是shi多duo方fang麵mian的de。一yi種zhong金jin屬shu離li子zi與yu某mou種zhong顯xian色se劑ji反fan應ying的de適shi宜yi酸suan度du範fan圍wei是shi通tong過guo實shi驗yan來lai確que定ding的de。確que定ding的de方fang法fa是shi固gu定ding待dai測ce組zu分fen及ji顯xian色se劑ji的de濃nong度du，改gai變bian溶rong液yepH值，測定其吸光度，作出吸光度-pH值關係曲線，選擇曲線平坦部分對應的pH值作為測定條件。
顯色反應一般在室溫下進行，有的反應需要加熱，以加速顯色反應，使之進行完全。
大da多duo數shu顯xian色se反fan應ying需xu要yao經jing過guo一yi定ding的de時shi間jian才cai能neng完wan成cheng，其qi長chang短duan與yu溫wen度du的de高gao低di有you關guan，也ye會hui受shou到dao空kong氣qi的de氧yang化hua或huo發fa生sheng光guang化hua學xue反fan應ying使shi眼yan色se顏yan色se減jian弱ruo。因yin此ci必bi須xu通tong過guo實shi驗yan作zuo出chu在zai一yi定ding溫wen度du下xia的de吸xi光guang度du-時間關係曲線，得到適宜的顯色時間。
幹擾的消除
1、幹擾的類型
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將幹擾測定。
a.幹擾離子本身有顏色
b.ganraolizibenshenwuyanse，dannengyuxiansejifanyingshengchengwendingdepeihewu。ruoshengchengdepeihewuyousezezhijieganraoceding，ruoshengchengdepeihewuwuse，yejiangdilexiansejidenongdu，yingxiangbeiceliziyuxiansejidefanying，erchanshengwucha。
c.幹擾離子與被測離子反應生成配合物或沉澱，影響被測離子的測定。
2、消除幹擾的方法
a.控製溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與幹擾離子形成更穩定的化合物，使幹擾離子不再產生幹擾。
c.裏用參比溶液消除某些有色幹擾離子的影響。
d.選擇適當的工作波長以消除幹擾。
e.采用適當的分離方法。
吸光度測量條件的選擇
1、入射光波長的選擇
應根據吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷，則未反應的顯色劑會造成幹擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發生吸收。而鈷絡合物則有一吸收平台。
2、參比溶液的選擇
（1）如果僅待測物與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑作參比溶液。
（2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
（3）如(ru)試(shi)樣(yang)中(zhong)其(qi)他(ta)組(zu)分(fen)有(you)吸(xi)收(shou)，但(dan)不(bu)與(yu)顯(xian)色(se)劑(ji)反(fan)應(ying)，則(ze)當(dang)顯(xian)色(se)劑(ji)無(wu)吸(xi)收(shou)時(shi)，可(ke)用(yong)試(shi)樣(yang)溶(rong)液(ye)作(zuo)參(can)比(bi)溶(rong)液(ye)，當(dang)顯(xian)色(se)劑(ji)略(lve)有(you)吸(xi)收(shou)時(shi)，可(ke)在(zai)試(shi)液(ye)中(zhong)加(jia)入(ru)適(shi)當(dang)掩(yan)蔽(bi)劑(ji)將(jiang)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)掩(yan)蔽(bi)後(hou)再(zai)加(jia)顯(xian)色(se)劑(ji)，以(yi)此(ci)溶(rong)液(ye)作(zuo)參(can)比(bi)溶(rong)液(ye)。
3、吸光度讀數範圍的選擇
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調整被測溶液的吸光度：
（1）控製被測溶液的濃度。如改變取樣量，改變溶液的濃縮倍數或稀釋倍數。
（2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
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