[實驗目的]

通過本實驗學習DNA的限製性內切酶酶切反應的基本原理與實驗技術。

[實驗原理]

1.限製性內切酶能特異地結合於一段被稱為限製性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,並切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴於ATP 的存在。Ⅰ類酶結合於識別位點並隨機的切割識別位點不遠處的DNA
，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA 分子,然後從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限製性內切核酸酶(限製酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。絕大多數Ⅱ類限製酶識別長度為4 至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數酶識別更長的序列或簡並序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產生平末端的DNA 片段(如Sma:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點在對稱軸一側,產生帶有單鏈突出末端的DNA 片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列後產生兩個互補的粘性末端。 5"…G↓AATTC…3" →5"…G AATTC…3" ；3"…CTTAA↑G …5" →3"…CTTAA G…5"

2.DNA 純度、緩衝液、溫度條件及限製性內切酶本身都會影響限製性內切酶的活性。大部分限製性內切酶不受RNA 或單鏈DNA 的影響。當微量的汙染物進入限製性內切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限製性內切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限製性內切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩衝液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限製性內切酶必須首先使用,隨後調節鹽濃度,再用高鹽濃度的限製性內切酶水解。也可在第一個酶切反應完成後，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc 和2倍體積無水乙醇，混勻後置於-70℃低溫冰箱內30 分鍾，離心、幹燥並重新溶於緩衝液後進行第二個酶切反應。

3.DNA 限製性內切酶酶切圖譜又稱DNA 的物理圖譜，它由一係列位置確定的多種限製性內切酶酶切位點組成
，以直線或環狀圖式表示。構建DNA 限xian製zhi性xing內nei切qie酶mei圖tu譜pu有you許xu多duo方fang法fa。通tong常chang結jie合he使shi用yong多duo種zhong限xian製zhi性xing內nei切qie酶mei，通tong過guo綜zong合he分fen析xi多duo種zhong酶mei單dan切qie及ji不bu同tong組zu合he的de多duo種zhong酶mei同tong時shi切qie所suo得de到dao的de限xian製zhi性xing片pian段duan大da小xiao來lai確que定ding各ge種zhong酶mei的de酶mei切qie位wei點dian及ji其qi相xiang對dui位wei置zhi。酶mei切qie圖tu譜pu的de使shi用yong價jia值zhi依yi賴lai於yu它ta的de準zhun確que性xing和he精jing確que程cheng度du。在zai酶mei切qie圖tu譜pu製zhi作zuo過guo程cheng中zhong
，為wei了le獲huo得de條tiao帶dai清qing晰xi的de電dian泳yong圖tu譜pu，一yi般banDNA 用量約為0.5-1μg。限製性內切酶的酶解反應最適條件各不相同,各種酶有其相應的酶切緩衝液和最適反應溫度(大多數為37℃)。對質粒DNA 酶切反應而言, 限製性內切酶用量可按標準體係1μg DNA 加1 單位酶,消化1-2 小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3 倍,甚至更多,反應時間也要適當延長。

[實驗儀器與設備]

水平式電泳裝置,電泳儀,台式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐,紫外透射儀,照相係統

[實驗材料]

λDNA; 重組pBS 質料或pUC19 質粒; EcoRI 酶及其酶切緩衝液; HindⅢ酶及其酶切緩衝液;瓊脂糖(Agarose)。

附試劑的配製：

1
、 5×TBE 電泳緩衝液：見實驗二。

2、 6×電泳載樣緩衝液：見實驗二。

3、 溴化乙錠：見實驗二。

[實驗步驟]

1.將清潔幹燥並經滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA1μg 和相應的限製性內切酶反應10×緩衝液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內溶液混勻後加入1μl 酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一 下,使溶液集中在管底。

2. 混勻反應體係後,將eppendorf 管置於適當的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保溫2-3 小時,使酶切反應完全。

3.每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應,置於冰箱中保存備用。

4.製備瓊脂糖凝膠分析內切酶酶切反應結果

配製1.5%瓊脂糖凝膠
，取10μl 酶解液與2μl 6×載樣液混勻電泳。保持電壓在60-80V

，電流在40mA.電泳結束後
，用EB染色20-25min,紫外燈下觀察結果。

[作業]

根據紫外燈下觀察的結果，畫出電泳示意圖，並討論內切酶酶切反應應注意的事項。

[實驗安排]

6學時