對於微量而且複雜的樣品，如蛋白質組學樣品、蛋白藥物中的殘留宿主細胞蛋白（HCP）等，不但需要高靈敏的納升級液相
，而且需要更為充分的分離。在線二維納升分離技術（on-line 2D NanoLC）應運而生，並已成為微量複雜樣品液質分析所必不可少的分離手段。
 

    傳統的納升在線二維技術，一般采用強陽離子交換（SCX）作為第一維，反相色譜（RP）作為第二維的分離手段。這種方法是根據樣品在鹽溶液中的離子特性與疏水性
，這兩種屬性間的正交關係實現的。但是SCX-RP技術在納升級分離中卻困難重重。困難主要來自SCX分離維度。在SCX分離中需要使用濃度較高的鹽溶液作為流動相，但含鹽流動相易發生鹽析或導致樣品在管路內沉澱，而納升液相的管路內徑又非常小（25-100微米）。因此，在實際運用SCX-RP分離時
，經常出現管路阻塞而導致實驗失敗。
   

    為此，除提供傳統的SCX-RP分離技術外，沃特世創造性地開發了雙反相二維分離方法。（RP-RP）。這種RP-RP技(ji)術(shu)不(bu)必(bi)使(shi)用(yong)高(gao)濃(nong)度(du)鹽(yan)溶(rong)液(ye)作(zuo)為(wei)流(liu)動(dong)相(xiang)
，避(bi)免(mian)了(le)離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)分(fen)離(li)易(yi)造(zao)成(cheng)的(de)管(guan)路(lu)阻(zu)塞(sai)問(wen)題(ti)，從(cong)而(er)大(da)大(da)提(ti)高(gao)了(le)納(na)升(sheng)二(er)維(wei)液(ye)相(xiang)的(de)係(xi)統(tong)穩(wen)定(ding)性(xing)和(he)實(shi)用(yong)性(xing)。更(geng)令(ling)人(ren)興(xing)奮(fen)的(de)是(shi)
，經(jing)過(guo)哈(ha)佛(fo)醫(yi)學(xue)院(yuan)的(de)Jarrod A. Marto全麵的實驗對比發現，較SCX-RP方法， 運用RP-RP分離技術得到的液質分析結果更好（圖1）[1] RP-RP雙反相二維方法可以幫助科學家得到更多的蛋白質分析結果.

這是因為：
1、SCX方法使用的鹽緩衝液易產生離子噪音背景
，從而影響質譜數據質量；
2、SCX分離效果取決於多肽所攜帶的電荷數
，而多肽攜帶電荷數量類別有限
，因此第一維SCX分離度較差

，造成液質數據信息質量不高。

                                      圖一

    R P-R P雙反相分離技術在第一
、第二維都使用了反相色譜，那麼它是如何實現二維分離所必須的分離性質的正交呢？原來，經過研究發現，在不同pH值環境下
，多肽的反相保留行為是不一樣的（圖2）[2]。根據這個性質，沃特世的科學家開發出了獨有的RP-RP納升在線二維係統——nanoACQUITY UPLC®  System with 2D-LC。這個係統的分離柱，使用了UPLC一貫的亞二微米顆粒填料，因此具有了UPLCdechaogaofenlidudengyoudian。ciwai
，tahaibuxuyaofenliujiukeyishixianjingzhundenashengliusu，keweishiyanshijieshengjudadegaochunduliudongxianggoumaifeiyongjifeiyechulifeiyong，erqiegengjiahuanbao。nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相二維係統優點總結如下：

■ 較SCX-RP技術，使用RP-RP係統可得到更多的蛋白鑒定結果。

■ RP-RP係統較SCX-RP係統更穩定、耐用。

■ 與nano HPLC相比，nanoACQUITY UPLC具有UPLC超群的分離效果。

■ 不分流實現精準的納

    nanoACQUITY UPLC System with 2D-LC雙反相在線二維係統結構及分析流程如圖3，其中包括三根色譜柱：高pH反相柱、捕獲柱、低pH反相柱。在此係統中
，第一維色譜柱為高pHsepuzhu。yangpinjinrudiyiweisepuzhuhou，diyiweitidubengkeanshiyongzheyaoqiu，zidongdijietishitigaoyoujixiangbili，yijiangyangpinzhongbutongshushuixingtaiduanfenpixituoxialai。conggaopH反相柱上洗脫下的多肽會被富集柱捕獲。每批次被富集的多肽，將在第二維泵的線性梯度模式下進入低pH反相分析柱
，在這裏經過充分分離後

，樣品將到達離子源，進入質譜分析器。
 

    其中左下圖為結構示意圖。步驟①：樣品被自動進樣器采集後，在第一維梯度泵的推動下進入高pH色譜柱。步驟②：樣品在第一維泵階梯式梯度作用下，將一部分多肽衝出，後被捕獲柱富集。其中第二維梯度泵通過施加9倍於第一維泵的水相流動相，將溶劑稀釋為適合捕獲柱富集的體係。步驟③：在六通閥切換後
，第二維泵通過線性梯度，將多肽樣品進行充分分離並送至質譜分析。在執行完步驟①後
，步驟②與步驟③交替進行直到完成所需分析。雙反相在線二維係統nanoACQUIT Y UP LC System with2D-LC已經在多肽的液質分析方麵被廣泛應用，幫助研究人員取得了眾多極具價值的研究成果。

 

參考文獻

(1) Zhou F, Cardoza JD, Ficarro SB, Adelmant GO, Lazaro JB, Marto JA. Online Nanoflow RP-RP-MS Reveals Dynamics of Multicomponent Ku Complex in Response to DNA Damage. J Proteome

Res. 2010, 9, 6242-6255.

(2) Gilar M, Olivova P, Daly AE, Gebler JC. Two-dimensionalseparation of peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second separation dimensions. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1694–1703.