控製菌檢驗方法驗證

建jian立li藥yao品pin的de微wei生sheng物wu限xian度du檢jian查zha時shi，進jin行xing控kong製zhi菌jun檢jian查zha方fang法fa的de驗yan證zheng，以yi確que認ren所suo采cai用yong的de方fang法fa適shi合he於yu該gai藥yao品pin的de的de控kong製zhi菌jun檢jian查zha方fang法fa測ce定ding。若ruo藥yao品pin的de組zu分fen或huo原yuan檢jian驗yan條tiao件jian發fa生sheng改gai變bian可ke能neng影ying響xiang檢jian驗yan結jie果guo時shi，檢jian驗yan方fang法fa應ying進jin行xing重zhong新xin驗yan證zheng。驗yan證zheng試shi驗yan也ye可ke與yu供gong試shi品pin的de控kong製zhi菌jun檢jian查zha同tong時shi進jin行xing。

1.1.驗證用菌株

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】或同等有效的

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】或同等有效的

乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】或同等有效的

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】或同等有效的

驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍幹燥菌種為0代），並采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。

1.2.菌液製備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10mL營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時；

分別取培養液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液
，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7
，製成每1ml含菌數10～100CFU的菌懸液。

1.3. 陰性菌對照組

設立陰性菌對照組是為了驗證該控製菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌
、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。

1.4.試驗組

常規法

【大腸埃希菌】取相當於1g或1mL供試品的供試液至100mL膽鹽乳糖培養基中
，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100CFU，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100CFU，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規定檢查。

【大腸菌群】取含適量（不少於10ml）的膽鹽乳糖發酵培養基管3支
，分別加入含供試品1g或1mL 
、0.1g或0.1mL、含供試品0.001g或0.001mL的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100CFU

，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100CFU
，35～37℃培養18～24小時
，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規定檢查。

【沙門菌】 取供試品10g或10mL，直接或處理後接種至適量（不少於200mL）的營養肉湯培養基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌 10～100CFU
，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100CFU，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

【銅綠假單胞菌】取相當於1g或1mL供試品的供試液至100mL膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100CFU，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100CFU，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

【金黃色葡萄球菌】取相當於1g或1mL供試品的供試液至100mL膽鹽乳糖培養基中
，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100CFU
，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100CFU
，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。

培養基稀釋法

供試品有抑菌作用

，放大培養基量
，由1：100放大到1：300

、1：500或1：1000，由於容器體積限製，一般放大到500mL或1000mL，本法適用於抑菌作用不強的樣品。

薄膜過濾法

采cai用yong薄bo膜mo過guo濾lv法fa時shi
，取qu規gui定ding量liang供gong試shi液ye，過guo濾lv，衝chong洗xi，試shi驗yan菌jun應ying加jia在zai最zui後hou一yi次ci衝chong洗xi液ye中zhong

，過guo濾lv後hou，注zhu入ru培pei養yang基ji或huo取qu出chu濾lv膜mo接jie入ru增zeng菌jun培pei養yang基ji中zhong。

離心沉澱集菌法

取規定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鍾離心3~5分鍾，取全部上清液，再以3000轉/分離心20分鍾，取下麵1mL液體
，並將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一並移入同瓶增菌液中
，培養，本法適用於中度抑菌作用的樣品。

中和法

在zai供gong試shi品pin溶rong液ye中zhong加jia入ru相xiang應ying的de中zhong和he劑ji
，以yi減jian除chu供gong試shi品pin中zhong抑yi菌jun成cheng分fen的de作zuo用yong，中zhong和he劑ji應ying對dui微wei生sheng物wu無wu毒du性xing，與yu抑yi菌jun成cheng分fen結jie合he後hou的de產chan物wu應ying對dui微wei生sheng物wu亦yi無wu毒du性xing
，或huo有you毒du性xing但dan不bu影ying響xiang待dai檢jian菌jun的de檢jian出chu。

1.5.結果判斷

至少應進行3cidulipingxingshiyan。yinxingjunduizhaozubudejianchuyinxingduizhaojun。ruoshiyanzujianchushiyanjun，zhaogaigongshiyezhibeifangfahekongzhijunjianzhafajinxinggaigongshipinkongzhijundejianzha；若試驗組未檢出試驗菌，應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法
、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。