慢病毒包裝技術專題

Q:什麼是慢病毒 ?

A: 慢病毒載體 (Lenti vector)是用於感染細胞以實現穩定導入基因或siRNA的病毒載體係統
，其感染效率可以達到100%。慢病毒和細胞結合後通過包裝蛋白將含有目的基因或者幹擾序列釋放到細胞內。慢病毒RNA通過逆轉錄酶轉錄為DNA。DNA整合前複合體進入細胞核並整合到靶細胞的染色體DNA。由於靶基因或基因幹擾序列整合到染色體上並且伴隨著細胞分裂時DNA的複製一起複製，基因的導入能夠獲得穩定的表達。慢病毒的顯著優勢在於其可以整合到非分裂細胞，而其他載體(如非病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體)不具備整合到靶細胞染色體的特性，或者隻能整合到分裂細胞的染色體(如常規的逆轉錄病毒)。目前我們使用的慢病毒載體是基於HIV-1改(gai)造(zao)而(er)來(lai)，該(gai)載(zai)體(ti)使(shi)用(yong)最(zui)為(wei)廣(guang)泛(fan)，經(jing)過(guo)科(ke)學(xue)家(jia)的(de)多(duo)次(ci)改(gai)造(zao)在(zai)包(bao)裝(zhuang)滴(di)度(du)和(he)使(shi)用(yong)安(an)全(quan)性(xing)等(deng)方(fang)麵(mian)都(dou)非(fei)常(chang)理(li)想(xiang)。在(zai)實(shi)際(ji)的(de)使(shi)用(yong)中(zhong)我(wo)們(men)可(ke)以(yi)用(yong)來(lai)表(biao)達(da)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)或(huo)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)加(jia)上(shang)報(bao)告(gao)基(ji)因(yin)，近(jin)年(nian)來(lai)隨(sui)著(zhe)RNAi研究的深入
，越來越多的科學家用慢病毒載體來表達幹擾序列.

Q:慢病毒用於rna i研究

A:目前慢病毒也被廣泛地應用於表達RNAi的研究中。由於有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑製作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限製。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體, 然後轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑製效果也不遜色於體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA表達載體中
，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的
，這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會帶poly A尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續4個或5個T時，它指導的轉錄就會停止
，在轉錄產物3’端形成1~4個U。U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位於轉錄區的上遊，適合於表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環結構(stem loop)。在siRNA表達載體中，構成siRNA的正義與反義鏈
，可由各自的啟動子分別轉錄,然後兩條鏈互補結合形成siRNA;也可由載體直接表達小發卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位於RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4～5T轉錄終止位點之間的莖環結構序列
，轉錄後即可折疊成具有1~4 個U 3 ’ 突出端的莖環結構
，在細胞內進一步加工成siRNA。構建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然後從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。

Q:如何生產病毒?

A:載體質粒和輔助質粒轉染293細胞後收獲病毒上清
，通過超濾和超速離心進行純化和濃縮獲得高滴度和高純度的慢病毒顆粒。

Q:病毒是否可以重新凍融?

A:病毒可以凍融
，但是反複多次的凍融會降低病毒的滴度。

Q:什麼是病毒的滴度?

A:病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數量。滴度值用於評估轉導一定數量靶細胞所需要的病毒數量。

Q:轉導單位(TU)的含義?

A:轉導單位(TU)即能夠感染並整合到細胞內的病毒載體基因組,

Q:MOI的含義?

A:MOI指用來轉染單個細胞的病毒數量，即含義是感染時病毒與細胞數量的比值。如果MOI為1則感染每個細胞的病毒顆粒數為1。同一種類同一批次的病毒感染不同種類的細胞，其MOI值不盡相同
，需要進行梯度實驗測算;另外不同的滴度檢測方法也會導致MOI很大的差異。

Q:可以獲得的病毒可以達到多少滴度?

A:常規生產的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。

Q:如何使用慢病毒感染細胞?

A:使(shi)用(yong)慢(man)病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)細(xi)胞(bao)的(de)操(cao)作(zuo)流(liu)程(cheng)取(qu)決(jue)於(yu)細(xi)胞(bao)種(zhong)類(lei)，因(yin)此(ci)首(shou)先(xian)要(yao)了(le)解(jie)細(xi)胞(bao)的(de)來(lai)源(yuan)和(he)背(bei)景(jing)，我(wo)們(men)將(jiang)在(zai)發(fa)貨(huo)時(shi)將(jiang)通(tong)用(yong)操(cao)作(zuo)流(liu)程(cheng)發(fa)送(song)客(ke)戶(hu)。通(tong)常(chang)來(lai)講(jiang)首(shou)先(xian)要(yao)根(gen)據(ju)準(zhun)確(que)的(de)MOI和需要感染的細胞量計算所需要的病毒量，然後將所需病毒也加入培養體係後4小時左右即可換成完全培養基正常培養。

Q:如何確定慢病毒感染靶細胞的感染效率?

A:慢病毒感染靶細胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測靶細胞中的慢病毒載體拷貝數來測算。另外如果構建的慢病毒載體帶有標記基因(如GFP、RFP等)，則可以通過FACS檢測陽性細胞的比例來評估感染效率。

Q:慢病毒感染靶細胞後，目的基因的表達是瞬時表達還是穩定表達?

A:慢病毒感染靶細胞後，目的基因或者幹擾序列被整合到細胞的染色體DNA;並且隨靶細胞的增殖分化，目的基因或者幹擾序列也隨靶基因DNA的一起複製並遺傳到子代細胞中,所以是穩定表達。

Q:通常生產一個慢病毒載體的實驗周期是多久?

A:我們將在收到您的訂單和實驗材料20個工作日左右完成病毒的生產和檢測，如果客戶需要委托購買或者合成目的基因(幹擾序列)，會增加相應的實驗周期。

Q:是否可以直接從慢病毒顆粒中提取慢病毒載體?

A:不可以。慢病毒載體用於轉染包裝細胞後生產病毒
，包裝好的病毒顆粒隻含有載體中5' and 3' LTR's的RNA。

Q:使用公司提供的病毒可以感染多少細胞?

A:可以感染的細胞量取決於您需要感染的靶細胞的易感性，原代細胞或者難感染的細胞需要較高的MOI,因此需要的病毒量也比較多。我們建議您可以通過預實驗確定目的細胞的MOI,即使用公司的GFP病毒設定不同的MOI(1
、5、10、15等)分別感染目的細胞。

Q:如何知道靶細胞是否能夠被慢病毒感染?

A:根gen據ju現xian有you的de研yan究jiu表biao明ming
，慢man病bing毒du感gan染ran譜pu很hen廣guang
，包bao括kuo分fen裂lie和he非fei分fen裂lie細xi胞bao。一yi方fang麵mian可ke以yi通tong過guo查zha詢xun文wen獻xian得de知zhi是shi否fou可ke以yi被bei感gan染ran
，另ling外wai也ye可ke以yi使shi用yong提ti供gong的deGFP慢病毒載體對照顆粒進行預實驗，確定細胞的易感性和MOI.

Q:在使用慢病毒時需要哪些預防措施?

A:慢病毒的操作要求在BSL2級別的生物安全櫃內進行，實驗操作人員需帶上乳膠手套
，按照標準的細胞培養操作流程進行。

Q:在實驗室使用慢病毒是否安全?

A:慢病毒載體包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白;載體成分則與包裝成分互補
，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV順shun式shi作zuo用yong序xu列lie
，同tong時shi具ju有you異yi源yuan啟qi動dong子zi控kong製zhi下xia的de多duo克ke隆long位wei點dian及ji在zai此ci位wei點dian插cha入ru的de目mu的de基ji因yin。為wei降jiang低di兩liang種zhong成cheng分fen同tong源yuan重zhong組zu恢hui複fu成cheng野ye生sheng型xing病bing毒du的de可ke能neng，需xu盡jin量liang減jian少shao二er者zhe的de同tong源yuan性xing

，如ru將jiang包bao裝zhuang成cheng分fen上shang5′LTR換成CMV (巨細胞病毒早期啟動子)、3′LTR換成SV40 polyA等。包裝成分通常被分開構建到兩個質粒上，一個質粒表達Gag和Pol蛋白，另一個質粒表達Env蛋白，其目的也是降低恢複成野生型病毒的可能。目前在用HIV-1載體已經進行的所有體內外實驗中，未出現過有複製力的HIV
，說明其安全性是有保證的。

Q:什麼是自身失活慢病毒載體(SIN )?

A:SIN 載體的構建是將載體3′LTR(長末端重複序列) 中的U3區增強子和啟動子序列刪除。U3-LTR 是前病毒DNA 兩端LTR 中U3 的模板, 在逆轉錄過程中, 3′L TR 中的缺失被傳遞到子代載體的5′L TR 中, 所形成的載體缺乏HIV-1 的增強子和啟動子序列, 即使在所有病毒蛋白都存在的情況下也不能轉錄RNA , 產生了一個滅活的前病毒, 但其中的外源啟動子仍然有活性, 能進行基因轉錄與表達。這種方式主要用來消除病毒LTR 中的啟動子/增強子序列對病毒載體中外源啟動子指導轉錄的幹擾作用
，以及消除可能的由3′L TR 啟動子指導的下遊基因組中原癌基因的激活與轉錄作用, 一定程度上提高了載體的安全性

Q:獲得慢病毒顆粒後是否可以在實驗室中進一步增殖?

A:不bu可ke以yi。科ke學xue家jia考kao慮lv到dao了le其qi使shi用yong的de生sheng物wu安an全quan性xing將jiang慢man病bing毒du載zai體ti改gai造zao成cheng為wei複fu製zhi缺que陷xian型xing病bing毒du載zai體ti。獲huo得de的de病bing毒du顆ke粒li的de基ji因yin組zu不bu具ju有you重zhong組zu所suo需xu要yao的de基ji因yin

，並bing且qie載zai體ti具ju有you3'LTR.自身失活的特性。

Q:慢病毒顆粒能保存多長時間?

A:在-80度條件下，慢病毒可以保存6個月左右而滴度沒有顯著丟失。

Q:公司生產的慢病毒的滴度是怎麼定義的?

A:公司生產的慢病毒的滴度是感染293T細胞後使用FACS檢測有限稀釋的病毒感染細胞的陽性細胞比例來測算
，或者使用Real-time PCR的方法檢測獲得的。