進入21世shi紀ji，隨sui著zhe蛋dan白bai質zhi組zu學xue的de研yan究jiu深shen入ru，對dui於yu多duo肽tai化hua學xue的de要yao求qiu不bu僅jin僅jin是shi合he成cheng方fang法fa，而er更geng多duo的de集ji中zhong在zai多duo肽tai標biao記ji與yu修xiu飾shi方fang法fa，以yi及ji蛋dan白bai結jie構gou與yu功gong能neng模mo擬ni多duo肽tai的de合he成cheng以yi及ji長chang肽tai或huo蛋dan白bai合he成cheng。

• 多肽化學合成的基本介紹

多肽化學合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現在主要采用BOC和Z兩(liang)種(zhong)保(bao)護(hu)方(fang)法(fa)，現(xian)在(zai)主(zhu)要(yao)應(ying)用(yong)在(zai)短(duan)肽(tai)合(he)成(cheng)，如(ru)阿(e)斯(si)巴(ba)甜(tian)
，力(li)肽(tai)，催(cui)產(chan)素(su)等(deng)
，其(qi)相(xiang)對(dui)與(yu)固(gu)相(xiang)合(he)成(cheng)，具(ju)有(you)保(bao)護(hu)基(ji)選(xuan)擇(ze)多(duo)，成(cheng)本(ben)低(di)廉(lian)，合(he)成(cheng)規(gui)模(mo)容(rong)易(yi)放(fang)大(da)的(de)許(xu)多(duo)優(you)點(dian)。與(yu)固(gu)相(xiang)合(he)成(cheng)比(bi)較(jiao)，液(ye)相(xiang)合(he)成(cheng)主(zhu)要(yao)缺(que)點(dian)是(shi)

，合(he)成(cheng)範(fan)圍(wei)小(xiao)
，一(yi)般(ban)都(dou)集(ji)中(zhong)在(zai)10個氨基酸以內的多肽合成，還有合成中需要對中間體進行提純
，時間長，工作量大。固相合成方法現在主要采用FMOC和BOC兩種方法，它具有合成方便，迅速
，容易實現自動化，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽。
1.1．氨基酸保護基 
20種常見氨基酸
，根據側鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val
，Leu
，Ile，），芳香族氨基酸（Phe
，Tyr，Trp
，His），酰胺或羧基側鏈氨基酸（Asp
，Glu，Asn
，Gln），堿性側鏈氨基酸（Lys
，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr）
，亞氨型基酸（Pro）。多肽化學合成中氨基酸的保護非常關鍵，直接決定了合成能夠成功的關鍵。因為常見的20中(zhong)氨(an)基(ji)酸(suan)中(zhong)有(you)很(hen)多(duo)都(dou)是(shi)帶(dai)有(you)活(huo)性(xing)側(ce)鏈(lian)的(de)，需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)保(bao)護(hu)，一(yi)般(ban)要(yao)求(qiu)，這(zhe)些(xie)保(bao)護(hu)基(ji)在(zai)合(he)成(cheng)過(guo)程(cheng)中(zhong)穩(wen)定(ding)，無(wu)副(fu)反(fan)應(ying)
，合(he)成(cheng)結(jie)束(shu)後(hou)可(ke)以(yi)完(wan)全(quan)定(ding)量(liang)的(de)脫(tuo)除(chu)。合(he)成(cheng)中(zhong)需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)保(bao)護(hu)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)包(bao)括(kuo)：Cys，Asp，Glu，His
，Lys，Asn，Gln，Arg
，Ser
，Thr
，Trp，Tyr。需要進行保護的基團：羥基，羧基，巰基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中Trp也可以不保護
，因為吲哚性質比較穩定。當然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護，象
，Asn
，Gln ，Thr，Tyr。 
表1 常見3種氨基脫除條件

 

圖1 常見3種氨基保護基結構
anjisuancelianbaohujituanfeichangduo，tongyigecelianyouduozhongbutongdebaohuji，keyizaibutongdetiaojianxiaxuanzexingdetuochu，zhedianzaihuantaiyijiduotaixiushishangjuyouhenzhongyaodeyiyi。erqiecelianbaohujihexuanzedehechengfangfayoumiqiedeguanxi，yexiangheguxiangbuyiyang，guxiangzhongBOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學就是氨基酸保護基的靈活運用與搭配。關於側鏈保護基的使用

，請參考王德心的《固相有機合成——原理及應用指南》第四章
，我們這裏主要介紹Cys，Lys
，Asp的幾種保護基及其脫除方法。Cys最常見的保護基有三種，Trt，Acm

，Mob，這三個保護基可以完成多對二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護基有：Boc，Fmoc，Trt，Dde
，Allyl，這對於固相合成環肽提供了很多正交的保護策略。Asp最常見的保護基有：Otbu，OBzl，OMe
，OAll
，OFm，同樣也提供了多種正交的保護策略。
表2 巰基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Trt		TFA，HCl/HOAc  ，I2/MeOH
Acm		I2/MeOH，Hg2+
Mob		HF，TFMSA  ，Hg2+

表3 氨基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Trt		TFA，HOAc，HCOOH
Boc		HCl/HOAc ，TFA/DCM
Fmoc		Pip/DMF，NaOH/MeOH
Dde		H2NNH2/DMF
Allyl		Pd（Ph3P）4，嗎啉/THF

表3 羧基常見保護基

簡稱	結構	脫除條件
Otbu		TFA，HOAc，HCOOH
OBzl		H2/Pd ，HF，TFMSA
OMe		NaOH/MeOH
OAll		Pd（Ph3P）4  ，嗎啉/THF
OFm		Pip/DMF，DBU/DMF

1.2．多肽縮合試劑 
muqianduotaihechengzhong，zhuyaocaiyongsuojihuohuafangfalaiwanchengjietaifanying，zuizaoshiyongdeshijianganjisuanhuohuaweixianlv，diedan，duichengsuanganyijihunhesuangandefangfa，danshiyouyuzhexietiaojianxia，cunzaianjisuanxiaoxuan
，yijifanyingshijiweixianyijizhibeibijiaofuza，zhujianbeihoulaidesuoheshijiqudai，anzhaoqijiegoukeyifenweiliangzhong：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。 
1.2.1．碳二亞胺型 
主要包括：DCC
，DIC
，EDC.HCl等。采用DCC進行反應
，由於反應中生成的DCU，在DMF中zhong溶rong解jie度du很hen小xiao
，產chan生sheng白bai色se沉chen澱dian，所suo以yi一yi般ban不bu用yong在zai固gu相xiang合he成cheng中zhong
，但dan是shi由you於yu其qi價jia格ge便bian宜yi，在zai液ye相xiang合he成cheng中zhong

，可ke以yi通tong過guo過guo濾lv除chu去qu
，應ying用yong仍reng然ran相xiang當dang廣guang泛fan。EDC.HClyinweiqishuirongjiexingdetedian，zaiduotaiyudanbaidelianjiezhongshiyongbijiaoduo，erqieyexiangdangchenggong。danshigaileixingdesuoheshijideyigezuidadequedian
，jiushiruguodandushiyong
，huiyoubijiaoduodefufanying，danshiyanjiubiaomingruguozaihuohuaguochengzhongtianjiaHOBt
，HOAt等試劑
，可以將其副反應控製在很低的範圍。其反應機理如下： 

圖2  DIC活化反應機理 
1.2.2．鎓鹽型 
鎓鹽型縮合試劑反應活性高，速度快，現在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM）
，該試劑加入後
，才能活化氨基酸。其反應機理如下： 

圖3  TBTU活化反應機理 
1.3．多肽合成方法比較 
1.3.1．液相多肽合成（solution phase synthesis） 
液ye相xiang多duo肽tai合he成cheng現xian在zai仍reng然ran廣guang泛fan的de使shi用yong，在zai合he成cheng短duan肽tai和he多duo肽tai片pian段duan上shang具ju有you合he成cheng規gui模mo大da
，合he成cheng成cheng本ben低di的de顯xian著zhu優you點dian，而er且qie由you於yu是shi在zai均jun相xiang中zhong進jin行xing反fan應ying，可ke以yi選xuan擇ze的de反fan應ying條tiao件jian更geng加jia豐feng富fu，象xiang一yi些xie催cui化hua氫qing化hua
，堿jian性xing水shui解jie等deng條tiao件jian，都dou可ke以yi使shi用yong，這zhe在zai固gu相xiang中zhong
，使shi用yong卻que由you於yu反fan應ying效xiao率lv低di，以yi及ji副fu反fan應ying等deng原yuan因yin
，無wu法fa應ying用yong。液ye相xiang多duo肽tai合he成cheng中zhong主zhu要yao采cai用yongBOC和Z兩種反應策略。 
 

 

圖4液相合成Glu-Trp 
1.3.2．固相多肽合成 
 

 

圖5  FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成現在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC方法合成過程中，需要反複使用TFA脫BOC，而且在最後從樹脂上切割下來需要使用HF，由於HF必須使用專門的儀器進行操作
，而且切割過程中容易產生副反應，因此現在使用受到實驗條件限製，使用也逐漸減少。FMOC方法反應條件溫和，在一般的實驗條件下就可以進行合成
，因此

，也得到了非常廣泛的應用。 
1.3.2.1．固相合成中常用樹脂 
固相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm

，交聯度在1-2%之間，現在使用的大多是1%，因為這種交聯度下，樹脂在DMF，DCMzhongjuyouhenhaoderongzhangxingneng，litishangshiyigekongjianwangzhuangjiegou，fanyingwufenzikeyizaishuzhineibuziyouyidong。shuzhizhongzuiguanjiandebufenshilianjieshoubi，tayiduanlianjiezaishuzhishang，yiduanzuoweifanyingweidian。muqianguangfanshiyongdeshuzhiyou：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM
，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩定，需要在HF，TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來。 
 

 

圖6  固相合成常用樹脂
1.3.2.2．茚三酮檢測 
固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上遊離氨基來判斷連接效率
，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有遊離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro

，ser，His）。 
Kaiser試劑包括： 
A，6% 茚三酮的乙醇溶液 
B，80% 苯酚的乙醇溶液 
C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液 
配製中的吡啶需要經過茚三酮處理後，重蒸後再使用。檢測過程
，取少量樹脂，加入A，B
，C各2-3滴
，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色
，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有遊離氨基
，否則說明連接完全。
還有其它檢測遊離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。 

圖7 茚三酮檢測原理 
1.3.2.3．固相合成切割方法 
固相合成完成之後
，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然後經過冰乙醚沉澱，離心收集沉澱，經過HPLCfenlichunhua
，lengdongganzaodedaozuihouchanpin。youyuxuanzedeshuzhibutong，anjisuanxuliebutong
，zaiqiegeshihou，xuanzedeqiegefangfayebuwanquanxiangtong，yibandoushixuanzesuanxingtiaojianxiaqiegedetiaojian，duiyuPAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割
，切割過程中需要添加對甲苯酚
，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對於Wang
，Rink-Amide，Trt樹脂
，一般采用TFA切qie割ge，切qie割ge過guo程cheng中zhong加jia入ru
，乙yi二er硫liu醇chun
，苯ben甲jia硫liu醚mi
，水shui，三san異yi丙bing基ji矽gui烷wan，苯ben酚fen等deng。這zhe些xie添tian加jia試shi劑ji主zhu要yao作zuo為wei碳tan正zheng離li子zi俘fu獲huo試shi劑ji使shi用yong，目mu的de是shi俘fu獲huo切qie割ge反fan應ying過guo程cheng中zhong生sheng成cheng的de碳tan正zheng離li子zi

，減jian少shao這zhe些xie碳tan正zheng離li子zi對dui部bu分fen氨an基ji酸suan側ce鏈lian的de進jin攻gong導dao致zhi的de副fu反fan應ying
，比bi較jiao容rong易yi產chan生sheng副fu反fan應ying的de氨an基ji酸suan有you：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反應一般是在室溫條件下2h-4h。 
1.3.3．多肽合成中主要問題 
1.3.3.1．消旋及其反應機理 
多肽合成過程中
，部分氨基酸在活化的過程中會導致不同程度的消旋，特別容易消旋的氨基酸有：Cys
，His，Phe，當dang然ran這zhe些xie消xiao旋xuan化hua還hai和he溶rong劑ji，溫wen度du以yi及ji合he成cheng中zhong的de有you機ji堿jian等deng因yin素su有you關guan。對dui於yu這zhe些xie氨an基ji酸suan，可ke以yi通tong過guo采cai用yong高gao效xiao縮suo合he試shi劑ji，減jian少shao反fan應ying時shi間jian，可ke以yi減jian少shao消xiao旋xuan的de比bi例li，一yi般ban條tiao件jian選xuan擇ze適shi當dang，消xiao旋xuan化hua都dou可ke以yi控kong製zhi在zai5%以內。消旋反應機理如下： 

圖8 消旋反應機理 
1.3.3.2．二酮呱嗪（DKP）反應 
DKP副反應出現在FMOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現在第一個氨基酸為Pro的時候，當第二個氨基酸脫FMOC的時候

，α-氨基被遊離出來之後，立即對Wang樹脂的苄酯鍵進行分子內胺解，生成六元環二酮呱嗪衍生物，同時從Wang樹脂上釋放出來
，導致反應終止。該反應非常迅速
，文獻報道采用50%Pip/DMF，脫1min，4min的條件
，但是我們實驗證明在多數情況下，即使是1min左右反應就超過了20%。因此一般在末端第一個氨基酸為Pro的時候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由於該樹脂巨大的空間阻力，可以完全消除該副反應。這個副反應在BOC策略合成過程中，卻可以完全避免，因為BOC在使用TFA脫除後，使氨基以TFA鹽的形式存在
，從而失去了親核性
，不能進攻苄酯鍵。 

圖9  DKP反應機理
1.3.3.3．困難序列多肽合成
固gu相xiang多duo肽tai合he成cheng中zhong也ye經jing常chang遇yu到dao多duo肽tai合he成cheng失shi敗bai或huo合he成cheng效xiao率lv很hen低di的de問wen題ti，這zhe裏li麵mian的de主zhu要yao原yuan因yin是shi由you於yu多duo肽tai序xu列lie引yin起qi的de，因yin為wei有you些xie多duo肽tai序xu列lie在zai樹shu脂zhi上shang形xing成chengβ-折疊，改變了樹脂的溶脹性能

，還有可能將反應的活性位點埋藏在樹脂裏麵

，這樣使得反應很難進行
，目前報道使用的主要方法有：

• 使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液
• 提高反應溫度，或采用微波方法
• 使用高離液鹽
  ，LiCl
  
  ，NaClO4等。
• 使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時減少樹脂擔載量（0.05-0.2mmol/g）

1.4．合成多肽分析鑒定方法 
多肽的分析鑒定方法有多肽一級結構
，二級結構鑒定，多肽一級結構包括：質譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級結構包括：圓二色譜（CD）
，NMR，X-衍射等方法。 
1.4.1．純度分析 
多肽的純度分析，一般都采用HPLC進行分析
，選擇RP-C18
，粒徑5μm，孔徑300A，4.6×150mm，流動相：A，0.1% TFA/H2O；B，0.1% TFA/ACN，洗脫梯度
，5%B--65%B
，時間30min。也有些多肽
，特別是短肽
，由於親水性強
，在C18上保留很弱，需要改變條件
，這裏主要有兩種方法：一個改變分析梯度
，可以將起始梯度改為2%，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強離子對試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。 
1.4.2．一級結構分析 
1.4.2.1．質譜分析 
質譜分析的目的主要是確證分子量，當然采用MS/MS可ke以yi部bu分fen的de了le解jie多duo肽tai序xu列lie的de信xin息xi
，但dan是shi這zhe個ge需xu要yao比bi較jiao全quan的de數shu據ju庫ku作zuo為wei基ji礎chu，分fen析xi才cai能neng比bi較jiao準zhun確que。由you於yu多duo肽tai性xing質zhi不bu穩wen定ding，需xu要yao采cai用yong軟ruan電dian離li技ji術shu，目mu前qian多duo肽tai分fen析xi主zhu要yao使shi用yong了le電dian噴pen霧wu（ESI-MS），基質輔助激光解吸（MALDI-MS）。其中ESI-MS通常會給出多電荷峰，電荷數目和多肽序列上氨基，胍基
，咪唑基的數目有關，因此
，經常給出了雙電荷
，三電荷等離子峰。MALDI-MS可(ke)以(yi)分(fen)析(xi)蛋(dan)白(bai)大(da)分(fen)子(zi)
，而(er)且(qie)通(tong)常(chang)情(qing)況(kuang)下(xia)很(hen)少(shao)帶(dai)多(duo)電(dian)荷(he)
，因(yin)此(ci)數(shu)據(ju)直(zhi)接(jie)對(dui)應(ying)了(le)分(fen)子(zi)離(li)子(zi)峰(feng)，容(rong)易(yi)分(fen)析(xi)。此(ci)外(wai)

，通(tong)常(chang)在(zai)分(fen)析(xi)長(chang)肽(tai)或(huo)蛋(dan)白(bai)過(guo)程(cheng)中(zhong)
，需(xu)要(yao)添(tian)加(jia)NH4
，Na
，K等離子
，提高靈敏度，所以一般在MS中出現一組峰，分別對應：（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。 
1.4.2.2．氨基酸組成分析 
anjisuanzuchengfenxiyibanxuyaochanpindechundujiaogao，takeyigeichuduotaizhonganjisuandezhonglei，shumu。fenxiguochengshouxiantongguosuanshuijiepohuaitaijian，dianxingsuanshuijiedetiaojianshi：真空條件下，110℃

，用6M鹽酸水解16至72xiaoshi。suanshuijiesuiranhenyouyong，dansuanshuijietiaojianxiabunenghuodewanzhengdeanjisuanfenxi，yinweitiandongxiananheguanxianandecelianhanyouxiananjian，yongyuqieduandanbaizhitaijiandesuanyekeyijiangtiandongxiananzhuanhuanweitiandongansuan，guanxiananzhuanhuanweiguansuan。youyushuijiewendubijiaogao

，seansuandeyinduohuanrongyibeikongqiyanghua
，jishizaimifengdeguanzhong，seansuandeyinduohuanyejihudoubeipohuaile。yincidanbaizhideseansuanhanliangwangwangshitongguotadeziwaixishouguangpugujide，yekeyitongguojianshuijiefenxiseansuandehanliang。banguangansuanzaisuanshuijiezhongyebunengjingqueceding
，yaojingqueceliangxuyaozaidanbaizhishuijiezhiqianjinxingyanghuahuosuojiajihua
，xingchengdeyanshengwuzaisuanshuijiezhihoucainengdingliang。 
1.4.2.3．氨基酸序列分析 
氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解
，主要涉及耦聯、水解、萃取和轉換等4個過程。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對蛋白質或多肽進行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。然後PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機溶劑（例如氯丁烷）從反應液中萃取出來，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩定
，經酸作用，再進一步環化，形成一個穩定的苯乙內酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重複進行上述反應過程
，整個測序過程現在都是通過測序儀自動進行。
1.4.3．二級結構分析 
1.4.3.1．圓二色譜（CD） 
圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它通過測量蛋白質等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級結構
，簡單、快捷，廣泛應用在蛋白質折疊，蛋白質構象研究，酶動力學等領域。圓二色譜紫外區段（190-240nm），主要生色團是肽鏈，這一波長範圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構象的信息。α-螺旋構象的CD譜在222nm、208nm處呈負峰，在190nm附近有一正峰。β-折疊構象的CD譜，在217-218nm處有一負峰，在195-198nm處有一強的正峰。無規則卷曲構象的CD譜在198nm附近有一負峰，在220nm附近有一小而寬的正峰。 
1.4.3.2．核磁共振(NMR)
隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為大分子結構物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、分布以及構象。目前
，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的
，分析結果快速準確。
1.4.3.3．X-衍射 
X-衍射可獲得有關化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對與絕對構型。

• 多肽標記及修飾

目前多肽標記及修飾的內容非常多，廣泛應用在多肽藥物
，多肽生物學，多肽抗體以及多肽試劑的研究中。目前應用廣泛的有：非放射性核素標記（C13，H2），熒光標記（FAM，FITC）
，生物素標記，磷酸化修飾等。 
2.1．非放射性核素標記 
目前在非放射性核素標記中，使用廣泛的仍然是C13，H2，因(yin)為(wei)其(qi)使(shi)用(yong)安(an)全(quan)，放(fang)射(she)性(xing)小(xiao)。現(xian)在(zai)有(you)比(bi)較(jiao)完(wan)全(quan)的(de)非(fei)放(fang)射(she)性(xing)標(biao)記(ji)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)
，可(ke)以(yi)按(an)照(zhao)正(zheng)常(chang)的(de)多(duo)肽(tai)合(he)成(cheng)方(fang)法(fa)將(jiang)標(biao)記(ji)好(hao)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)直(zhi)接(jie)連(lian)接(jie)到(dao)多(duo)肽(tai)上(shang)。 
2.2．熒光標記 
熒ying光guang標biao記ji由you於yu沒mei有you放fang射she性xing
，實shi驗yan操cao作zuo簡jian單dan。因yin此ci
，目mu前qian在zai生sheng物wu學xue研yan究jiu中zhong熒ying光guang標biao記ji應ying用yong非fei常chang廣guang泛fan，熒ying光guang標biao記ji方fang法fa與yu熒ying光guang試shi劑ji的de結jie構gou有you關guan係xi，對dui於yu有you遊you離li羧suo基ji的de采cai用yong的de方fang法fa與yu接jie肽tai反fan應ying相xiang同tong，也ye采cai用yongHBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對於FITC標記
，需要在連接FITC前，增加一個氨基己酸，避免在切割的過程中被TFA切割掉。 
2.3．生物素標記 
生物素-親合素係統 (biotin-avidin system
，BAS)，是70年(nian)代(dai)後(hou)期(qi)應(ying)用(yong)於(yu)免(mian)疫(yi)學(xue)
，並(bing)得(de)到(dao)迅(xun)速(su)發(fa)展(zhan)的(de)一(yi)種(zhong)新(xin)型(xing)生(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)放(fang)大(da)係(xi)統(tong)。由(you)於(yu)它(ta)具(ju)有(you)生(sheng)物(wu)素(su)與(yu)親(qin)合(he)素(su)之(zhi)間(jian)高(gao)度(du)親(qin)和(he)力(li)及(ji)多(duo)級(ji)放(fang)大(da)效(xiao)應(ying)，並(bing)與(yu)熒(ying)光(guang)素(su)、酶、同位素等免疫標記技術有機地結合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進一步提高。主要有用於標記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用


，當然
，也可以直接使用生物素也可以標記
，因為其結構上有個遊離的羧基
，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由於生物素的溶解度低
，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。 
2.4．磷酸肽合成 
磷酸肽在生命過程中發揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser，Thr
，Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單苄基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方(fang)法(fa)，但(dan)是(shi)目(mu)前(qian)采(cai)用(yong)該(gai)方(fang)法(fa)合(he)成(cheng)磷(lin)酸(suan)化(hua)也(ye)有(you)缺(que)點(dian)，特(te)別(bie)是(shi)在(zai)合(he)成(cheng)多(duo)磷(lin)酸(suan)化(hua)多(duo)肽(tai)或(huo)長(chang)肽(tai)的(de)時(shi)候(hou)
，連(lian)接(jie)效(xiao)率(lv)低(di)，最(zui)後(hou)產(chan)品(pin)純(chun)度(du)很(hen)低(di)
，對(dui)於(yu)這(zhe)種(zhong)磷(lin)酸(suan)化(hua)多(duo)肽(tai)，我(wo)們(men)考(kao)慮(lv)采(cai)用(yong)後(hou)磷(lin)酸(suan)化(hua)方(fang)法(fa)，其(qi)合(he)成(cheng)過(guo)程(cheng)就(jiu)是(shi)在(zai)多(duo)肽(tai)合(he)成(cheng)結(jie)束(shu)後(hou)，選(xuan)擇(ze)性(xing)脫(tuo)去(qu)要(yao)標(biao)記(ji)的(de)氨(an)基(ji)酸(suan)的(de)側(ce)鏈(lian)保(bao)護(hu)基(ji)

，對(dui)於(yu)Tyr，Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCMtiaojianxiakeyidingliangdetuochu。houlinsuanhua，caiyongshuangbianjiyalinxianan，sidanzuoshengchengyalinxianansizuohuoxingzhongjianti，lianjiedaoqiangjishang
，suihouzaiguoyangsuanxiayanghuashengchenglinxianji
，wanchengfanying。

• 蛋白結構與功能模擬多肽

多duo肽tai在zai與yu蛋dan白bai受shou體ti結jie合he發fa揮hui功gong能neng的de時shi候hou，總zong是shi先xian折zhe疊die出chu某mou些xie特te殊shu的de結jie構gou，多duo肽tai類lei似si物wu合he成cheng主zhu要yao是shi為wei了le模mo擬ni這zhe些xie結jie構gou，保bao持chi或huo提ti高gao生sheng物wu活huo性xing，同tong時shi也ye為wei了le改gai變bian多duo肽tai的de穩wen定ding性xing，提ti高gao其qi抗kang酶mei解jie能neng力li。 
3.1．α-螺旋多肽 
α-螺旋是蛋白結構中最為普通的一種
，但是一般多肽在溶液中大多是無規卷曲的，目前使用最多的方法是多肽保持α-螺旋結構就是在多肽表麵通過共價鍵將處在α-螺旋結構的兩個氨基酸連接起來，選擇的位點（i
，i+4或i，i+7），選擇的化學鍵包括：二硫鍵，硫醚鍵
，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等方法。 
3.1.1．二硫鍵 
二硫鍵廣泛存在與蛋白結構中，對穩定蛋白結構具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基，經氧化形成。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法
，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應進程進行監測。 
3.1.2．硫醚鍵 
硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys，將溴乙酸連接到Lys的側鏈氨基上，利用其和巰基的特異性反應，反應在緩衝溶液中進行，迅速高效。 
3.1.3．酰胺鍵 
多肽的內酰胺環肽的合成一般是利用Lys，Asp（Glu）的選擇性保護
，在固相上直接環化。BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm）
，FMOC策略中可以采用FMOC-Lys（Aloc），FMOC-Asp（Allyl）。對於首尾環肽，還可以先合成保護的多肽，然後在液相中環化生成目標多肽。 
3.1.4．烯烴鍵（RCM） 
RCM反應是一個過渡金屬催化反應，其反應中使用催化劑：(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh，可以催化烯烴環化
，過程中脫去一分子乙烯。 

圖10  固相RCM反應 
該反應也可以在固相樹脂上直接環化,反應條件：15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃，24-48h。 
3.2．TASP（template-assembled synthetic peptide）多肽 
瑞士Basel大學的化學家首次提出TASP的概念，他們利用具有“發夾”結構的肽鏈作為模板


，然後將具有α-螺旋結構的多肽直接連接到模板上，模擬蛋白質的高級結構。 
3.3．長肽或蛋白合成 
3.3.1．FMOC-tbu片段縮合方法
FMOC-tbu片(pian)段(duan)縮(suo)合(he)方(fang)法(fa)在(zai)合(he)成(cheng)長(chang)肽(tai)以(yi)及(ji)蛋(dan)白(bai)上(shang)麵(mian)運(yun)用(yong)非(fei)常(chang)廣(guang)泛(fan)，其(qi)合(he)成(cheng)過(guo)程(cheng)首(shou)先(xian)是(shi)合(he)成(cheng)保(bao)護(hu)性(xing)肽(tai)片(pian)段(duan)，經(jing)過(guo)純(chun)化(hua)後(hou)
，將(jiang)幾(ji)個(ge)片(pian)段(duan)在(zai)液(ye)相(xiang)或(huo)固(gu)相(xiang)上(shang)組(zu)裝(zhuang)起(qi)來(lai)。使(shi)用(yong)本(ben)方(fang)法(fa)主(zhu)要(yao)注(zhu)意(yi)幾(ji)個(ge)方(fang)麵(mian)：片段的選擇，片段的合成與純化，片段縮合方法。片段選擇要考慮到片段連接反應時間長，容易導致消旋，故片段的C末端最好選擇Gly
，Pro。合成的片段一般需要經過C4
，C8等(deng)純(chun)化(hua)，對(dui)於(yu)溶(rong)解(jie)性(xing)很(hen)差(cha)的(de)多(duo)肽(tai)
，可(ke)以(yi)采(cai)用(yong)矽(gui)膠(jiao)柱(zhu)層(ceng)析(xi)方(fang)法(fa)進(jin)行(xing)純(chun)化(hua)。由(you)於(yu)片(pian)段(duan)的(de)分(fen)子(zi)大(da)
，在(zai)樹(shu)脂(zhi)內(nei)移(yi)動(dong)速(su)度(du)慢(man)，故(gu)反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)一(yi)般(ban)都(dou)很(hen)長(chang)
，而(er)且(qie)反(fan)應(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)與(yu)片(pian)段(duan)濃(nong)度(du)關(guan)係(xi)很(hen)大(da)，溶(rong)解(jie)的(de)時(shi)候(hou)
，盡(jin)量(liang)提(ti)高(gao)片(pian)段(duan)的(de)濃(nong)度(du)。對(dui)多(duo)種(zhong)條(tiao)件(jian)的(de)選(xuan)擇(ze)，發(fa)現(xian)采(cai)用(yong)DMF為溶劑，DIC/HOBt的方法縮合效率最高，消旋也最小。

圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖
3.3.2．自然化學連接（Native Chemical Ligation）
自(zi)然(ran)化(hua)學(xue)連(lian)接(jie)方(fang)法(fa)的(de)優(you)點(dian)是(shi)可(ke)以(yi)采(cai)用(yong)完(wan)全(quan)脫(tuo)保(bao)護(hu)的(de)多(duo)肽(tai)，因(yin)此(ci)不(bu)存(cun)在(zai)溶(rong)解(jie)性(xing)問(wen)題(ti)，其(qi)反(fan)應(ying)也(ye)是(shi)在(zai)緩(huan)衝(chong)水(shui)溶(rong)液(ye)中(zhong)進(jin)行(xing)，由(you)於(yu)其(qi)利(li)用(yong)的(de)是(shi)巰(qiu)基(ji)和(he)硫(liu)酯(zhi)的(de)特(te)異(yi)性(xing)反(fan)應(ying)，再(zai)經(jing)過(guo)由(you)S到N的轉變完成肽鍵的合成。 

圖13自然化學連接
總zong之zhi，今jin後hou多duo肽tai化hua學xue的de研yan究jiu，不bu僅jin是shi將jiang更geng多duo的de有you機ji化hua學xue合he成cheng新xin方fang法fa，新xin技ji術shu引yin入ru到dao多duo肽tai研yan究jiu當dang中zhong，而er且qie對dui蛋dan白bai的de結jie構gou以yi及ji功gong能neng模mo擬ni，開kai展zhan結jie構gou活huo性xing研yan究jiu（structure activity relationship）將是研究開發的熱點，因為這將為揭示蛋白的內在的生物活性本質提供大量實驗數據。