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目的建立甘草苷和甘草酸的HPLC含量測定方法。方法使用KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸（20:80）為流動相，檢測波長276nm，柱溫為室溫；甘草酸流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1），檢測波長252nm，柱溫為室溫。二者流速均為1.0ml·min-1，采用外標法定量測定。結果甘草苷在2.7～27μg·ml-1範圍內呈良好線性關係（r=0.9997）；甘草酸在6～36μg·ml-1範圍內呈良好線性關係（r=0.9998）；甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%和101.3%，其RSD值分別為1.18%和1.22%。結論該方法操作簡便、準確，線性相關係數良好，且穩定性和重複性好，適用於甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的含量測定。
經典的黃酮含量測定方法，是以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定［3～5］，但此方法用於甘草黃酮的測定尚有諸多不足之處。甘草黃酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黃酮內在質量的一個重要指標［6］。本研究以甘草苷為對照品，采用HPLC法測定甘草黃酮含量的方法，同時研究優化以HPLC測定甘草酸含量的方法，以期為甘草有效成分的綜合開發利用和質量監控提供新的方法和思路。
1儀器與材料1.1儀器LC-10A高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-10A可變紫外檢測器（日本島津）；萬分之一天平（Sartorius）；KQ-250B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）。
1.2材料甘草（石河子天德中藥廠）。甘草苷對照品、甘草酸單銨鹽對照品（均購自中國藥品生物製品檢定所）；95%乙醇（A.R）、冰醋酸（A.R）、乙酸胺（A.R）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）。
2方法與結果2.1色譜分析條件2.1.1甘草苷檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為乙腈-0.5%醋酸（20∶80）；紫外檢測波長：276nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進樣量20μl。理論塔板數按甘草酸銨峰計算應不低於4000。對照品和甘草黃酮粗提物的色譜圖見圖1～2。
2.1.2甘草酸檢測條件色譜柱為KromasiL-C18（4.6mm×200mm，5μm）；流動相為甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）；紫外檢測波長252nm；流速1.0ml·min-1；柱溫為室溫；進樣量20μl。理論塔板數按甘草酸銨峰計算應不低於2000。
2.2對照品及供試品溶液的配製2.2.1對照品溶液的配製取甘草苷和甘草酸單銨鹽對照品適量，精密稱定，用流動相配製成濃度為54μg·ml-1的甘草苷對照品溶液和120μg·ml-1的甘草酸單銨鹽對照品溶液。
2.2.2供試品溶液的製備精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應的流動相溶解，定溶於10ml量瓶中，作為甘草苷供試品溶液。
精密稱取甘草黃酮提取物適量，用相應的流動相溶解，定溶於10ml量瓶中，作為甘草酸供試品溶液。
2.3檢測波長的選擇以流動相為參比溶液，在200～400nm波長範圍內分別對甘草苷和甘草酸對照品溶液進行掃描，結果表明，甘草苷在276nm處有一最大吸收峰，甘草酸在252nm處有一最大吸收峰，所以選定276nm為甘草苷的檢測波長，252nm為甘草酸的檢測波長。
2.4線性關係的考察精密吸取甘草苷對照品儲備液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00ml於10ml量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻；再精密吸取甘草酸單銨鹽對照品儲備液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00ml於10ml量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻；分別按“2.1”項色譜條件進行測定，以峰麵積A（μV·s）對進樣濃度C（μg·ml-1）作回歸統計，結果：甘草苷在2.7～27μg·ml-1範圍內線性良好，回歸方程：A=24962C 7161.1，r=0.9997。
甘草酸在6～36μg·ml-1範圍內線性良好，回歸方程為：A=23653C 23125，r=0.9998。
2.5精密度實驗取同一供試品溶液，重複進樣6次，求得甘草苷的RSD為0.74%，甘草酸的RSD為0.92%，說明本方法精密度良好。
2.6重複性實驗按“2.2.2”項製備同一批號供試品溶液6份，按擬定的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的含量，測得甘草苷的RSD為1.32%，甘草酸的RSD為1.04%，表明重複性較好。
2.7穩定性實驗配製同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h後進樣，求得甘草苷的RSD為1.44%，甘草酸的RSD為0.89%，表明樣品溶液在48h內穩定。
2.8回收率實驗取已知含量的同一供試品溶液各5份fen，分fen別bie精jing密mi加jia入ru同tong一yi濃nong度du同tong一yi體ti積ji的de甘gan草cao苷gan對dui照zhao品pin溶rong液ye，甘gan草cao酸suan單dan銨an鹽yan對dui照zhao品pin溶rong液ye，混hun勻yun，進jin樣yang，按an上shang述shu方fang法fa測ce定ding甘gan草cao酸suan和he甘gan草cao苷gan的de含han量liang，測ce得de甘gan草cao苷gan和he甘gan草cao酸suan的de平ping均jun回hui收shou率lv分fen別bie為wei101.4%，101.3%；RSD值分別為1.18%，1.22%。表明本實驗所確定的HPLC法進行甘草苷和甘草酸的含量分析，準確度較高。結果見表1。表1甘草酸和甘草苷的回收率實驗結果2.9樣品測定分別精密稱定甘草黃酮粗提物和純化物各3份，適量，按“2.2.2”項方法製備所需的供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的峰麵積，計算甘草黃酮粗提物（烘幹樣）中甘草苷和甘草酸的純度分別為3.68%和18.38%，甘草黃酮純化物（烘幹樣）中甘草苷的純度為17.29%，未檢測到甘草酸。
測定項甘草黃酮粗提物123平均值RSD甘草黃酮純化物123平均值RSD甘草酸純度18.2518.5118.3918.380.71-----甘草苷純度3.623.733.693.681.5117.1617.3117.4017.290.70“-”為未檢測到。
3討論3.1甘草苷流動相的選擇考察了選用不同比例的乙腈-0.5%醋酸為流動相時對甘草苷的保留時間及分離度的影響。實驗結果表明，以乙腈-0.5%醋酸（10∶90）為wei流liu動dong相xiang時shi，保bao留liu時shi間jian短duan，但dan峰feng形xing較jiao差cha，乙yi腈jing比bi例li增zeng大da後hou峰feng形xing變bian得de較jiao尖jian銳rui對dui稱cheng，響xiang應ying值zhi顯xian著zhu增zeng大da，分fen離li度du逐zhu漸jian改gai善shan，保bao留liu時shi間jian先xian增zeng大da後hou縮suo短duan，當dang乙yi腈jing比bi例li大da於yu20%後，未檢測到甘草苷，綜合考慮，選用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）為流動相，甘草苷的保留時間適中，分離效果好。
3.2甘草酸流動相的選擇本實驗分別選用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相，實驗結果表明，甲醇-2%乙酸（73∶27）和甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰乙酸（67∶32∶1）為流動相時，分離效果均較好，但在流動相的穩定性和分析時間的合理性方麵，後者更優越，因此選用甲醇-0.2mol·L-1乙酸銨溶液-冰醋酸（67∶32∶1）為流動相。
按(an)本(ben)法(fa)分(fen)別(bie)對(dui)甘(gan)草(cao)苷(gan)和(he)甘(gan)草(cao)酸(suan)進(jin)行(xing)高(gao)效(xiao)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)分(fen)析(xi)，具(ju)有(you)回(hui)收(shou)率(lv)和(he)線(xian)性(xing)相(xiang)關(guan)係(xi)數(shu)良(liang)好(hao)，操(cao)作(zuo)簡(jian)便(bian)，快(kuai)速(su)，樣(yang)品(pin)用(yong)量(liang)少(shao)，精(jing)密(mi)度(du)和(he)重(zhong)複(fu)性(xing)好(hao)，自(zi)動(dong)化(hua)程(cheng)度(du)高(gao)等(deng)優(you)點(dian)，適(shi)用(yong)於(yu)甘(gan)草(cao)黃(huang)酮(tong)粗(cu)提(ti)物(wu)及(ji)純(chun)化(hua)物(wu)中(zhong)甘(gan)草(cao)苷(gan)和(he)甘(gan)草(cao)酸(suan)的(de)質(zhi)量(liang)控(kong)製(zhi)，具(ju)有(you)廣(guang)泛(fan)的(de)應(ying)用(yong)前(qian)景(jing)。
