細胞培養是細胞生物學研究方法中最常用也是最重要的技術之一，在現代醫學、生物科學、nongyekexuedenglingyubeiguangfanyingyongyitigongyanjiumoxingheshiyancailiao。zaixibaopeiyangguochengzhong，wanquanpeiyangjiduixibaoshengchangzhuangtaiqidaoguanjianzuoyong，juedingshiyanchenggongyufou。erxueqingshiwanquanpeiyangjizhongdeguanjianchengfenzhiyi

，chuweixibaoshengchangtigongjibenyingyangwuzhi、結合蛋白、一yi些xie參can與yu解jie毒du代dai謝xie的de微wei量liang元yuan素su和he可ke起qi到dao中zhong和he保bao護hu的de酶mei類lei之zhi外wai，還hai可ke以yi保bao護hu細xi胞bao免mian受shou機ji械xie損sun傷shang，因yin此ci被bei業ye內nei認ren為wei是shi細xi胞bao增zeng殖zhi過guo程cheng中zhong最zui重zhong要yao的de試shi劑ji。在zai生sheng命ming科ke學xue領ling域yu的de細xi胞bao培pei養yang技ji術shu中zhong
，動dong物wu血xue清qing的de應ying用yong十shi分fen廣guang泛fan，特te別bie是shi牛niu來lai源yuan血xue清qing。而er牛niu源yuan血xue清qing又you分fen為wei胎tai牛niu血xue清qing、新生牛血清和小牛血清，它們的區別方式主要由於牛齡和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗體水平含量低對後續實驗結果影響小、生長因子含量水平高利於細胞增殖而應用最廣。因此關注胎牛血清的品級、質量以及使用過程的一些注意事項
，會對實驗結果起到直接影響作用，並可以確保科研人員在實驗操作過程中的安全性。

今天我們就來看看在細胞培養過程中血清使用方麵常見的問題，如：血清儲存條件
、如何程序解凍、細胞汙染與血清之間的關係、傳說中的“黑膠蟲”是什麼以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通過今天的解析與學習可以讓我們在做細胞培養相關實驗時事半功倍！那我們就開始吧~

Q1：血清長期儲存的條件和方法是什麼？

A1：血清如需長期保存，則必須儲存於-10℃或更低溫冰箱中，建議存放於-20℃的冰箱中。研究表明儲存在-80℃條件下的血清在性能方麵變化不大
，但由於解凍時溫差過大
，會導致析出更多沉澱

，使得背景雜亂，因此血清長期保存不建議處於-80℃條件下。如果近期會頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過1個月

；若一次無法用完整瓶

，建議分裝後保存，且要避免反複凍融。另外
，血清冰凍後體積會增加約10%，因此血清分裝時請留意預留一定的體積空間。

Q2：如何進行血清的程序性解凍？血清才不會使產品質量受損？

A2：程(cheng)序(xu)性(xing)解(jie)凍(dong)血(xue)清(qing)可(ke)以(yi)確(que)保(bao)血(xue)清(qing)製(zhi)品(pin)質(zhi)量(liang)的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)
，且(qie)不(bu)會(hui)因(yin)為(wei)溫(wen)差(cha)過(guo)大(da)而(er)析(xi)出(chu)過(guo)多(duo)蛋(dan)白(bai)等(deng)沉(chen)澱(dian)。程(cheng)序(xu)性(xing)解(jie)凍(dong)方(fang)法(fa)是(shi)於(yu)實(shi)驗(yan)開(kai)始(shi)之(zhi)前(qian)將(jiang)冷(leng)凍(dong)的(de)血(xue)清(qing)置(zhi)於(yu)4℃冰箱中融解，並且在解凍過程中每隔1小時搖勻一次，使溫度與成分均一
，減少沉澱析出，直至全部解凍
，然後再移入室溫條件下使用。

Q3：血清解凍後發現絮狀沉澱該如何處理
？

A3：zaochengxueqingfashengxuzhuangchendiandeyuanyinzhuyaoshixueqingjiedongguochengzhongwenchadailaidezhidanbaibianxinghexianweidanbaixichu。chendianbenshenbuhuiyingxiangxueqingzhiliang，yebuhuiduishiyanjieguozaochengyingxiang。danrubixuchulichendian
，zeketongguolixinfangshiquchu
，ru500-1000g離心5-10 min。

Q4：血清沉澱是什麼
？

A4：用yong於yu細xi胞bao培pei養yang的de胎tai牛niu血xue清qing及ji其qi他ta血xue類lei製zhi品pin中zhong均jun存cun在zai各ge種zhong類lei型xing的de沉chen澱dian

，如ru纖xian維wei蛋dan白bai和he磷lin酸suan鈣gai等deng。一yi些xie絮xu狀zhuang沉chen澱dian主zhu要yao就jiu是shi纖xian維wei蛋dan白bai，通tong常chang我wo們men肉rou眼yan可ke見jian
，大da小xiao在zai1-2mm之間；而er磷lin酸suan鈣gai在zai顯xian微wei鏡jing下xia觀guan察cha呈cheng現xian布bu朗lang運yun動dong的de小xiao黑hei點dian，通tong常chang被bei誤wu認ren為wei是shi微wei生sheng物wu汙wu染ran。血xue清qing沉chen澱dian往wang往wang比bi較jiao難nan以yi預yu測ce和he控kong製zhi
，但dan幸xing運yun的de是shi這zhe些xie沉chen澱dian不bu會hui影ying響xiang血xue清qing品pin質zhi。

Q5：血清中的小黑點是“黑膠蟲”麼
？

A5：血清解凍過程溫差過大


、經反複凍融或通過熱滅活處理後更容易產生沉澱，這些沉澱物在鏡下觀察時有一些會呈現以布朗運動的小黑點。業內流行一種“黑膠蟲”汙染的說法
，但“黑膠蟲”一直以來都是極為神秘的存在，至今科學家們也沒有完整的實驗結果可以證實它究竟是一種生物還是非生物
，更有人認為“黑膠蟲”是shi血xue清qing的de原yuan蟲chong
，或huo誤wu以yi為wei是shi細xi菌jun或huo真zhen菌jun汙wu染ran。但dan科ke學xue家jia通tong過guo進jin一yi步bu的de研yan究jiu發fa現xian它ta們men更geng可ke能neng是shi血xue清qing中zhong的de蛋dan白bai結jie晶jing。這zhe種zhong結jie晶jing可ke能neng為wei蛋dan白bai析xi出chu
，如ru纖xian維wei蛋dan白bai原yuan凝ning結jie成cheng纖xian維wei蛋dan白bai；或是鹽析出，如磷酸鈣等；也有一些是膽固醇和脂肪酸。

Q6：如何判斷血清汙染
？

A6：（1）首先檢查並判斷外包裝是否有破損
，一般瓶身破損的血清發生汙染的可能性極大
；

（2）將血清接種到血酯板上，培養後看是否有菌落形成
；

（3）可通過質量檢測試劑盒檢測結果判定
，如支原體檢測試劑盒等。血清汙染主要包括細菌汙染、真菌汙染和支原體汙染。在細胞培養時想要確定血清存在細菌汙染，可嚐試使用5-10倍濃度青鏈黴素雙抗衝擊培養24-48h；真菌汙染的細胞無法搶救
，應立即將細胞瓶進行高壓滅菌處理

，並徹底消毒培養箱；支原體汙染可考慮更換早期代次細胞，或使用商品化支原體去除試劑。

Q7：細胞形態不正常、生長狀態異常或增殖速率緩慢是否與血清有關？

A7：細胞形態異常需要綜合關注細胞代次、傳代操作
、培pei養yang基ji和he血xue清qing等deng諸zhu多duo因yin素su。如ru傳chuan代dai次ci數shu過guo多duo或huo傳chuan代dai時shi間jian過guo晚wan都dou有you可ke能neng影ying響xiang細xi胞bao的de生sheng長chang狀zhuang態tai。有you些xie細xi胞bao對dui血xue清qing具ju有you一yi定ding適shi應ying性xing，更geng換huan新xin批pi次ci血xue清qing時shi可ke能neng出chu現xian所suo含han因yin子zi水shui平ping的de差cha異yi而er導dao致zhi的de細xi胞bao生sheng長chang狀zhuang態tai受shou到dao影ying響xiang的de現xian象xiang，可ke以yi通tong過guo血xue清qing梯ti度du替ti換huan或huo者zhe增zeng加jia細xi胞bao適shi應ying時shi間jian來lai解jie決jue此ci類lei問wen題ti。與yu此ci同tong時shi也ye要yao關guan注zhu基ji礎chu培pei養yang基ji和he傳chuan代dai操cao作zuo等deng方fang麵mian是shi否fou存cun在zai一yi定ding問wen題ti。

Q8：如何做血清的梯度替換
？

A8：當dang細xi胞bao培pei養yang實shi驗yan需xu更geng換huan血xue清qing品pin牌pai時shi，做zuo程cheng序xu性xing梯ti度du替ti換huan方fang案an尤you為wei重zhong要yao，因yin為wei不bu同tong品pin牌pai的de血xue清qing所suo含han成cheng分fen有you所suo差cha異yi
，血xue清qing更geng換huan會hui使shi細xi胞bao發fa生sheng不bu適shi，從cong而er出chu現xian細xi胞bao增zeng殖zhi緩huan慢man或huo細xi胞bao狀zhuang態tai不bu佳jia等deng情qing況kuang。建jian議yi的de梯ti度du替ti換huan方fang法fa為wei：完全培養基配置過程中先用25%新血清與75%原血清進行混合
，培養傳代1-2次；而後用50%新血清與50%原血清混合培養傳代；再用75%新血清與25%原血清混合培養傳代；最後完全使用新血清培養傳代。

Q9：培養基中添加血清和抗生素後可長期保存嗎?

A9：新鮮培養基中添加血清和抗生素後，建議在2周內使用完。

Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?

A10：實shi驗yan表biao明ming，經jing熱re滅mie活huo處chu理li的de血xue清qing對dui細xi胞bao生sheng長chang可ke能neng僅jin有you微wei小xiao促cu進jin或huo完wan全quan沒mei有you任ren何he作zuo用yong，甚shen至zhi通tong常chang因yin高gao溫wen處chu理li而er損sun失shi掉diao血xue清qing中zhong部bu分fen營ying養yang成cheng分fen從cong而er影ying響xiang血xue清qing質zhi量liang，造zao成cheng細xi胞bao生sheng長chang速su率lv降jiang低di。熱re滅mie活huo過guo程cheng中zhong因yin局ju部bu溫wen度du過guo高gao、搖yao晃huang不bu均jun勻yun或huo滅mie活huo時shi間jian過guo長chang
，都dou會hui造zao成cheng血xue清qing品pin質zhi下xia降jiang，且qie經jing熱re滅mie活huo後hou的de血xue清qing會hui增zeng加jia發fa生sheng蛋dan白bai沉chen澱dian概gai率lv。因yin此ci
，若ruo非fei必bi須xu血xue清qing不bu需xu要yao做zuo熱re滅mie活huo，而er少shao數shu對dui補bu體ti敏min感gan的de細xi胞bao實shi驗yan
，如ru某mou些xie免mian疫yi學xue實shi驗yan或huo腺xian病bing毒du包bao裝zhuang等deng，可ke酌zhuo情qing對dui血xue清qing進jin行xing熱re滅mie活huo操cao作zuo。

Q11：血清熱滅活應如何操作？

A11：（1）熱滅活前，必須先將解凍後的血清搖勻，並恢複至室溫；

（2）取部分搖勻血清置於50ml離心管中，並準備同規格對照管一個；

（3）對照管內加入血清等體積水
；

（4）對照管內插入溫度計進行溫度預試，當溫度達到 56℃時將恢複至室溫的血清放入水浴鍋30min
；

（5）滅活過程中需要每隔5min輕輕晃動搖勻
，以保證溫度均一。

Q12：血清為什麼存在批間差？

A12：血清批間差是客觀存在的
，因為血清製品來源於天然活體，供體牛隻的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養環境的地形、風貌
、飲食、水源等影響，體內各類蛋白
、shengchangyinzihemeileidehanliangjunyoujudachayi，suoyixueqingjuyouhanliangfuzaqiebugudingdetexing，pijianchayizaisuonanmian，yincipijianchayixiaodexueqingbujinkeyibaozhengxueqingzhiliang，quebaoxibaopeiyangxiaoguo
，hainengjianshaoyouyupijianchayidailaideshiyongqianceshi
，qiebimianshiyanjieguodebukezhongfuxing。

既然血清在細胞培養過程中如此重要
，那麼我們又該如何選擇靠譜的血清呢？

1.中國海關允許進口的血源地

世界動物衛生組織（OIE）對國家或地區動物感染性疾病有相關評價指標
，如瘋牛病風險評價指標GBR就是根據瘋牛病風險等級進行地域性風險評估及分類。目前世界上僅有一些少數國家在OIE對牛類風險性疾病的評估中符合中國海關要求，因此中國海關允許進口的血清來源地有澳大利亞

、新西蘭
、烏(wu)拉(la)圭(gui)，這(zhe)些(xie)國(guo)家(jia)來(lai)源(yuan)的(de)牛(niu)血(xue)類(lei)製(zhi)品(pin)的(de)生(sheng)物(wu)安(an)全(quan)等(deng)級(ji)較(jiao)高(gao)
，科(ke)研(yan)人(ren)員(yuan)在(zai)使(shi)用(yong)相(xiang)關(guan)來(lai)源(yuan)的(de)血(xue)類(lei)製(zhi)品(pin)時(shi)極(ji)大(da)降(jiang)低(di)了(le)感(gan)染(ran)疾(ji)病(bing)的(de)風(feng)險(xian)，市(shi)麵(mian)上(shang)其(qi)他(ta)血(xue)源(yuan)地(di)的(de)血(xue)清(qing)都(dou)是(shi)非(fei)法(fa)走(zou)私(si)血(xue)清(qing)，要(yao)選(xuan)擇(ze)在(zai)瓶(ping)身(shen)明(ming)確(que)標(biao)注(zhu)來(lai)源(yuan)地(di)的(de)血(xue)清(qing)產(chan)品(pin)。

2.血源可溯性

由於血清利潤價值高昂、血源緊缺
、不同原產國血清價格有差異、通過偽造血清來源從而進行利潤賺取使血清用戶深受困擾等原因
，使得血源可溯源至關重要。目前血清行業中有Oritain指紋識別技術，該技術可為每批血清進行來源溯源認證，有效證實血清產品來源。

3.國際機構認證

國際血清行業協會（ISIA）成立於2006年6月(yue)
，旨(zhi)在(zai)建(jian)立(li)全(quan)球(qiu)動(dong)物(wu)血(xue)清(qing)和(he)動(dong)物(wu)源(yuan)性(xing)產(chan)品(pin)質(zhi)量(liang)標(biao)準(zhun)，促(cu)進(jin)和(he)確(que)保(bao)血(xue)清(qing)和(he)動(dong)物(wu)源(yuan)性(xing)產(chan)品(pin)供(gong)應(ying)符(fu)合(he)標(biao)準(zhun)和(he)倫(lun)理(li)規(gui)範(fan)，現(xian)已(yi)成(cheng)為(wei)血(xue)清(qing)行(xing)業(ye)規(gui)範(fan)及(ji)血(xue)清(qing)供(gong)應(ying)商(shang)身(shen)份(fen)驗(yan)證(zheng)標(biao)準(zhun)的(de)製(zhi)定(ding)者(zhe)。ISIA實施了供應鏈可追溯性的行業標準，這對確保血清各個批次的質量、安全性和重複性起了關鍵作用。該組織在胎牛血清生產過程中主要對原料采集、血清加工
、產品質檢和出國運輸等環節進行監控及認證。

4.進口合規性

合規的進口血清應該具備多項資質證明文件，包括原產地證明、衛生證/健康證/農業部非疫區證明
、進口貨物報關單以及入境貨物檢驗檢疫證明。其中原產地證明（CERTIFICATE OF ORIGIN）可以追溯貨物原產地或製造地，衛生證/健康證/農業部非疫區證明（ HC, HEALTH CERTIFICATE, TES/BSE）可以確保血清供體來源是健康、非疫區和無傳染病的。

5.嚴格質控

由於牛血清在人用疫苗和獸用疫苗等生物製藥生產中非常重要
，很多國家都將其納入藥典，在我國的中華人民共和國藥典Ch.P、美國藥典USP和歐洲藥典 EP 中都規定了牛血清的定義和質量標準，如內毒素、總蛋白含量、血紅蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。此外，9種牛類傳染性疾病的檢測結果也十分重要
，分別是牛呼吸道融合病毒(BRSV)
、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、 牛細小病毒(BPV)、藍舌病毒(BTV)、 牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道腸道病毒(REO)等deng

，這zhe些xie病bing毒du部bu分fen是shi人ren畜chu共gong患huan病bing
，病bing毒du檢jian測ce不bu合he格ge的de血xue清qing甚shen至zhi會hui影ying響xiang科ke研yan人ren員yuan的de健jian康kang與yu安an全quan。因yin此ci我wo們men要yao選xuan擇ze質zhi控kong標biao準zhun嚴yan格ge按an照zhao各ge國guo藥yao典dian要yao求qiu，並bing遵zun循xunFDA頒布執行的cGMP規範生產流程的血清供應商，可在血清生產等各個環節保證產品質量。

6.批間差異小

pijianchayixiaodexueqingbujinkeyibaozhengxueqingzhiliang
，quebaoxibaopeiyangxiaoguo，hainengjianshaoyouyupijianchayidailaideshiyongqianceshi，qiebimianshiyanjieguodebukezhongfuxing。