1.變性：在第一輪循環前，在94℃下變性5~10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解鏈，然後加入Taq DNA聚合酶(hot start)
，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板複合物所造成的錯誤。變性不完全
，往往使PCR 失敗，因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快複性
，減少DNA 產量。一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA 解鏈隻需幾秒鍾即可完全
，所耗時間主要是為使反應體係完全達到適當的溫度。對於富含GC 的序列，可適當提高變性溫度，但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。

2.退火：這是PCR deyigeguanjiancanshu。zailixiangzhuangtaixia，tuihuowenduzugoudi
，yibaozhengyinwutongmudexulieyouxiaotuihuo，tongshihaiyaozugougao，yijianshaofeiteyixingjiehe。helidetuihuowenducong55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm 低5℃, 當產物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時
，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。如果兩個引物Tm 不同
，將退火溫度設定為比最低的Tm 低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm 設計的退火溫度先進行5 個循環，然後在根據較低Tm 設she計ji的de退tui火huo溫wen度du進jin行xing剩sheng餘yu的de循xun環huan。這zhe使shi得de在zai較jiao為wei嚴yan緊jin的de條tiao件jian下xia可ke以yi獲huo得de目mu的de模mo板ban的de部bu分fen拷kao貝bei。退tui火huo溫wen度du越yue高gao
，所suo得de產chan物wu的de特te異yi性xing越yue高gao。有you些xie反fan應ying甚shen至zhi可ke將jiang退tui火huo與yu延yan伸shen兩liang步bu合he並bing

，隻zhi用yong兩liang種zhong溫wen度du(例如用60℃和94℃)wanchengzhenggekuozengxunhuan，jishengshijianyoutigaoleteyixing。tuihuoyibanjinxushumiaozhongjikewancheng
，fanyingzhongsuoxushijianzhuyaoshiweishizhenggefanyingtixidadaoheshidewendu。

3.延伸：延伸反應通常為72℃，接近於Taq DNA 聚合酶的最適反應溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度範圍可從20℃-85℃。延伸反應時間的長短取決於目的序列的長度和濃度。在一般反應體係中
，Taq DNA聚合酶每分鍾約可合成1kb 長的DNA。延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)會(hui)導(dao)致(zhi)產(chan)物(wu)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)增(zeng)加(jia)。但(dan)對(dui)很(hen)低(di)濃(nong)度(du)的(de)目(mu)的(de)序(xu)列(lie)
，則(ze)可(ke)適(shi)當(dang)增(zeng)加(jia)延(yan)伸(shen)反(fan)應(ying)的(de)時(shi)間(jian)。一(yi)般(ban)在(zai)擴(kuo)增(zeng)反(fan)應(ying)完(wan)成(cheng)後(hou)
，都(dou)需(xu)要(yao)一(yi)步(bu)較(jiao)長(chang)時(shi)間(jian)(10-30min)的延伸反應，以獲得盡可能完整的產物，這對以後進行克隆或測序反應尤為重要。

4.循環次數： 當其它參數確定之後，循環次數主要取決於DNA 濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多，會使PCR 產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30 輪循環擴增後，反應中Taq DNA 聚合酶已經不足，如果此時產物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA 樣品稀釋10³-10⁵倍作為模板，重新加入各種反應底物進行擴增，這樣經60 輪循環後
，擴增水平可達10⁹-10¹⁰。擴增產物的量還與擴增效率有關
，擴增產物的量可用下列公式表示：C＝C₀(1+P)n 。其中：C 為擴增產物量，C₀ 為起始DNA 量，P 為增效率，n weixunhuancishu。zaikuozenghouqi，youyuchanwujilei
，shiyuanlaichengzhishukuozengdefanyingbianchengpingtandequxian，chanwubuzaisuixunhuanshuermingxianshangsheng，zhechengweipingtaixiaoying。pingtaiqihuishiyuanxianyouyucuopeierchanshengdedinongdufeiteyixingchanwujixudaliangkuozeng
，dadaojiaogaoshuiping。yinci
，yingshidangtiaojiexunhuancishu，zaipingtaiqiqianjieshufanying，jianshaofeiteyixingchanwu。