蛋(dan)白(bai)濃(nong)度(du)測(ce)定(ding)的(de)方(fang)法(fa)有(you)很(hen)多(duo),但(dan)每(mei)種(zhong)方(fang)法(fa)都(dou)有(you)其(qi)特(te)點(dian)和(he)局(ju)限(xian)性(xing),因(yin)而(er)需(xu)要(yao)在(zai)了(le)解(jie)各(ge)種(zhong)方(fang)法(fa)的(de)基(ji)礎(chu)上(shang)根(gen)據(ju)不(bu)同(tong)情(qing)況(kuang)選(xuan)用(yong)恰(qia)當(dang)的(de)方(fang)法(fa),以(yi)滿(man)足(zu)不同的要求。例如凱氏定氮法結果精確,但操作複雜,用於大批量樣品的測試則不太合適;Lowry法精確度較高,但是比較費時,且每步的時間要求相對嚴格;Bradford法靈敏簡便,但易受去垢劑的影響;BCA法以其試劑穩定,抗幹擾能力強,結果穩定,靈敏度高而受歡迎。
1. Bradford法:
原理:在酸性環境中,蛋白質結合考馬斯亮藍G250染料,導致染料的吸收峰發生位移,從紅棕色形式(吸收峰 465nm)轉化為藍色形式(吸收峰 610nm)。這兩種形式在 595nm 處光吸收差異most大,因此 595nm 是測定考馬斯染料-蛋白複合物的藍色的bestbochang。jiehedaomeigedanbaizhifenzishangdekaomasiranliaofenzishudazhiyudanbaisuodaizhengdianhedeshuliangchengzhengbi,yincitongguobisefakeyicedingrongyezhongdanbaizhidehanliang。
優點:
1. 靈敏度高,可以檢測到1μg/ml的蛋白質濃度。
2. 反應時間短,反應時間隻需5-10分鍾。
3. 操作簡單,隻需加入試劑,混合均勻即可。
4. 適用範圍廣,適用於大部分類型的蛋白質。
5. 不受溶液中還原劑的影響。
缺點:
1. 受幹擾:某些離子和化合物會幹擾測定結果,去垢劑(表麵活性劑)會產生強烈幹擾,使得與許多常用的緩衝液不兼容。
2. 靈敏度不穩定:不同蛋白質的靈敏度不同,有些蛋白質可能無法被檢測到。肽或蛋白質的分子量必須大於 3,000 道爾頓才能被檢出。
3. 需要標準曲線:需要製備標準曲線來計算蛋白質濃度,增加了操作步驟。
近來市場上已出現能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒,可以兼容各種常用的蛋白緩衝液,大大拓展了應用範圍。
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