聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction
，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法
，為常用的分子生物學技術之一。其基本步驟是，首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈
，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時
，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應完成後，將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降後
，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環可以重複多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。

PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此

，引物的優劣直接關係到PCR的特異性與成功與否。

要設計引物首先要找到DNA序(xu)列(lie)的(de)保(bao)守(shou)區(qu)。同(tong)時(shi)應(ying)預(yu)測(ce)將(jiang)要(yao)擴(kuo)增(zeng)的(de)片(pian)段(duan)單(dan)鏈(lian)是(shi)否(fou)形(xing)成(cheng)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)。如(ru)這(zhe)個(ge)區(qu)域(yu)單(dan)鏈(lian)能(neng)形(xing)成(cheng)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)，就(jiu)要(yao)避(bi)開(kai)它(ta)。如(ru)這(zhe)一(yi)段(duan)不(bu)能(neng)形(xing)成(cheng)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)，那(na)就(jiu)可(ke)以(yi)在(zai)這(zhe)一(yi)區(qu)域(yu)設(she)計(ji)引(yin)物(wu)。

現在可以在這一保守區域裏設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基
，擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多於4個連續堿基的互補。

引物確定以後，可以對引物進行必要的修飾
，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾
，因為引物的延伸是從3′端開始的。這裏還需提醒的是3′端不要終止於密碼子的第3位
，因為密碼子第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則：

①引物應用核酸係列保守區內設計並具有特異性。

②產物不能形成二級結構。

③引物長度一般在15~30堿基之間。

④G+C含量在40%~60%之間。

⑤堿基要隨機分布。

⑥引物自身不能有連續4個堿基的互補。

⑦引物之間不能有連續4個堿基的互補。

⑧引物5′端可以修飾。

⑨引物3′端不可修飾。

⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。