凡是需要做分子生物學實驗的lab

，肯定逃不了要買一台核酸定量的機器。目前最為流行的儀器是Nanodrop
，隻需滴加一兩微升的樣品
，按一下按鈕，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到濃度數據。近幾年，以Qubitweidaibiaodejiyuteyiyingguangranliaofadeyiqiyezhujianjinrukeyanrenyuandeshiye。name

，zheliangleiyiqiyoushenmequbie，zaishiyongshixuyaozhuyishenme，ruhegenjushiyanshixuqiulaixuangou?如下文所示。

首先我們需要來理解兩台儀器在核酸定量原理上的區別。正如方才所言，Nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。

Nanodrop

檢測方法原理為核酸
、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵係統，能吸收紫外光
，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波長處。一般在260nm波長下，每1ml含1μg RNA溶液的光吸收值為0.022~0.024，每1ml含1μg DNA溶液的光吸收值約為0.020，故測定未知濃度RNA或DNA溶液在260nm的(de)光(guang)吸(xi)收(shou)值(zhi)即(ji)可(ke)計(ji)算(suan)出(chu)其(qi)中(zhong)核(he)酸(suan)的(de)含(han)量(liang)。此(ci)法(fa)操(cao)作(zuo)簡(jian)便(bian)，迅(xun)速(su)。若(ruo)樣(yang)品(pin)內(nei)混(hun)雜(za)有(you)大(da)量(liang)的(de)核(he)苷(gan)酸(suan)或(huo)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等(deng)能(neng)吸(xi)收(shou)紫(zi)外(wai)光(guang)的(de)物(wu)質(zhi)，則(ze)測(ce)光(guang)誤(wu)差(cha)較(jiao)大(da)，故(gu)應(ying)設(she)法(fa)事(shi)先(xian)除(chu)去(qu)。NanoDrop及其它紫外分光光度計均采用紫外吸光度進行檢測，它無法區分出DNA、RNA、降解核酸、遊離核苷酸及其它雜質。盡管紫外吸收定量法是最常用的一種DNA或RNA定量方法，但其讀數並不可靠，不能用於後續建庫的參考。

Qubit

Qubit熒光計是新一代核酸和蛋白定量儀，實驗台上可以對DNA和RNA進行精準定量，它可以采用熒光染料檢測特定目標分子的濃度。它采用的是熒光檢測技術，該技術采用與DNA
、RNA或蛋白質結合後才發出熒光的Molecular Probes® 染ran料liao。這zhe些xie熒ying光guang染ran料liao可ke以yi特te異yi地di與yu不bu同tong種zhong類lei的de核he酸suan鏈lian相xiang結jie合he
，並bing在zai特te定ding波bo長chang光guang源yuan的de激ji發fa下xia，發fa出chu熒ying光guang。其qi中zhong，結jie合he了le核he酸suan的de熒ying光guang染ran料liao，相xiang比bi那na些xie遊you離li的de
，信xin號hao可ke增zeng幅fu數shu十shi倍bei至zhi數shu百bai倍bei
，因yin此ci可ke以yi和he背bei景jing區qu分fen開kai來lai。目mu前qian，做zuo測ce序xu的de實shi驗yan室shi基ji本ben把baQubit當標配儀器了。

雖然以Nanodrop為代表的紫外吸收法在科研領域已經沿用了數十年
，但由於原理上的限製
，這一類儀器有無法避免的缺陷。

1
、紫外吸收法無法區分DNA和RNA

這一點其實在原理上就很好理解了。如下圖所示，具有紫外吸收的結構是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基
，因此當一份樣品同時含有DNA和RNA的時候
，無論你本意是想測哪一個，均會高估其真實濃度。

而Qubit的熒光染料法則避免了這個問題。隻要采用DNA、RNA特異的染料，就能有選擇性地測定樣品中的核酸濃度。下圖是Qubit的官方測試數據。這個實驗是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，並用Qubit法和紫外吸收法分別進行測定。當DNA的樣品足夠純時(DNA：RNA = 10：0)，兩種方法測得的數值並沒有顯著區別。但當混入的RNA越來越多，紫外吸收的數值也跟著升高(藍色和綠色柱子)
，而使用雙鏈DNA染料的Qubit數值則沒有改變(紅色柱子)。使用RNA染料用Qubit進行測定
，則會發現，隨著RNA混入的增加，讀數也跟著升高。

目前
，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質均有特異的熒光染料。也就是說，無需專門純化樣品，或者在未知汙染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

2


、紫外吸收法的定量限較高

對於任何儀器分析
，都具備其檢出限和定量限。Nanodrop標稱的檢出限是2ng/µl(雙鏈DNA)，然而定量限則遠高於此。其他的Nanodrop用戶也有類似的體驗，曾經在ResearchGate上看到說
，低於50ng/µl的話就容易測不準
，變異度會增大。以下同樣是來自Qubit的官方數據。當DNA的濃度低於某個程度時，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了。

Qubit與紫外吸收法測定低濃度DNA時的偏差及變異度比較

這兩張圖中
，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來已經算小的了，要低於4 ng/µl雙鏈DNA才會出現問題。然而在實際使用中，低於10甚至20 ng/µl時就比較容易出亂子。而PCR產物膠回收等應用，最終的實際濃度往往就落在這個容易測不準的範圍內。

3、紫外吸收法對溶液的pH和鹽濃度敏感 

在研究物質吸光度時，我們總要明確地定義緩衝液的離子強度以及pH，這就說明，吸光度本身是受到這兩個因素影響的。

通常而言，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數值。相反
，偏堿的溶液則容易高估。相應地，也有報道稱，當用水作為溶劑時
，紫外吸收測定的數值變異度增大，而當使用Tris或Tris-EDTA溶液進行測定時，重複性就提高了。這其中的原因，很可能是空氣中溶解入水中的CO₂濃度差異造成的。離子強度對於紫外吸收的影響比較複雜
，這裏不展開。

相比之下，熒光染料法對樣品的汙染和pH等的容忍度較大。

4、紫外吸收法對降解比較嚴重的核酸無能為力 

這(zhe)一(yi)點(dian)
，同(tong)樣(yang)也(ye)是(shi)由(you)紫(zi)外(wai)吸(xi)收(shou)原(yuan)理(li)的(de)局(ju)限(xian)性(xing)所(suo)決(jue)定(ding)的(de)。紫(zi)外(wai)吸(xi)收(shou)測(ce)定(ding)的(de)對(dui)象(xiang)是(shi)堿(jian)基(ji)，因(yin)此(ci)無(wu)論(lun)核(he)酸(suan)是(shi)完(wan)整(zheng)成(cheng)鏈(lian)的(de)，還(hai)是(shi)降(jiang)解(jie)成(cheng)單(dan)個(ge)遊(you)離(li)核(he)苷(gan)酸(suan)

，該(gai)方(fang)法(fa)均(jun)無(wu)法(fa)加(jia)以(yi)區(qu)分(fen)。盡(jin)管(guan)我(wo)們(men)可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)A260/A280數值是否過大來估計核酸樣品的降解狀況，但卻無法選擇性地隻測定那些結構完整的核酸的濃度。

eryingguangranliaotongchangjiehedeshihesuandelianjiegou，bingbuhuiyuyoulidedanhegansuanxianghuzuoyong。buguohuashuohuilai，duiyunaxieshangweijiangjiechengdangehegansuanerchengduanlianzhuangtaidehesuan，yingguangranliaofashiwufajiangqiyuwanzhenghesuanqufenkailaide。

結語

如果在實驗中獲得的核酸樣品總是很純淨且均一(如原材料是容易對付的培養細胞，還用品質好的試劑盒進行抽提；而非奇奇怪怪的極端樣品，還要是自己配的試劑)
，同時產量又很高，那紫外吸收法完全可以勝任
，外加測定速度秒殺熒光染料法。此外，熒光染料法對溫度比較敏感，比如上一回是在25℃室溫製作並儲存的標準曲線


，而這一回要測定樣品時實驗室空調壞掉
，一下子有了3℃以上的溫差，那麼標曲就得重新製作。同時
，熒光染料要現用現配，樣品至少要染2min，花費的時間比紫外吸收法要長。