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色譜又稱色層法或層析法，是一種物理化學分析方法，它利用不同溶質(樣品)與固定相和流動相之間的作用力(分配、吸附、離子交換等)的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質達到相互分離。
01柱色譜
weixiangboliguanzhongtianrugudingxiang，yiliudongxiangrongjijinrunhouzaishangfangdaorudaifenliderongye，zaidijialiudongxiang，yinweidaifenliwuzhiduigudingxiangdexifulibutong，xifulidadeguzhebudonghuoyidonghuanman，xifulixiaodebeiliudongxiangrongjixixialaisuiliudongxiangxiangxialiudong，congershixianfenli。02紙色譜
以(yi)濾(lv)紙(zhi)條(tiao)為(wei)固(gu)定(ding)相(xiang)，在(zai)紙(zhi)條(tiao)上(shang)點(dian)上(shang)待(dai)分(fen)離(li)的(de)混(hun)合(he)溶(rong)液(ye)的(de)樣(yang)點(dian)，將(jiang)紙(zhi)條(tiao)下(xia)端(duan)浸(jin)入(ru)流(liu)動(dong)相(xiang)溶(rong)劑(ji)中(zhong)懸(xuan)掛(gua)，溶(rong)劑(ji)因(yin)為(wei)毛(mao)細(xi)作(zuo)用(yong)沿(yan)濾(lv)紙(zhi)條(tiao)上(shang)升(sheng)，樣(yang)點(dian)中(zhong)的(de)溶(rong)質(zhi)從(cong)而(er)被(bei)分(fen)離(li)。
03薄(bo)層(ceng)色(se)譜(pu)是(shi)在(zai)玻(bo)璃(li)板(ban)上(shang)塗(tu)以(yi)固(gu)定(ding)相(xiang)塗(tu)層(ceng)，然(ran)後(hou)點(dian)樣(yang)，下(xia)端(duan)浸(jin)入(ru)溶(rong)劑(ji)，同(tong)樣(yang)自(zi)下(xia)而(er)上(shang)分(fen)離(li)。常(chang)用(yong)於(yu)探(tan)索(suo)柱(zhu)色(se)譜(pu)實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)，溶(rong)劑(ji)和(he)固(gu)定(ding)相(xiang)的(de)選(xuan)擇(ze)等(deng)。
常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、澱粉等，常用流動相為水、苯等各種有機溶劑。
影響色譜柱使用壽命的主要因素 流動相因素
1.流動相pH
不同基質的填料具有不同的pH適用範圍。常溫下無定形矽膠在純水中的溶解度約為100mg/L，且在pH1～9的範圍內溶解的矽膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對於矽膠基質的填料,其所能承受的流動相pH範圍約為1～8。
鍵合相矽膠填料則由於鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應範圍大大增加，如現在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基矽烷鍵合矽膠)，其pH適用範圍可達2～10。當流動相pH值超出酸性範圍時，鍵合相易發生水解而流失；當流動相pH超出堿性範圍時，會加速矽膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應均是不可逆反應，特別是在溫度較高>40℃）的環境下，會使柱效迅速降低而報廢。2.流動相變質
dangqianshiyongzuiweiguangfandeshiguijijianhexiangtianliao，dangyishuirongyezuoweiliudongxianghuoliudongxiangzhonghanyouyidingnongdudelinsuanyanhuanchongyeshi，shuirongyezhonghuohuanchongyanrongyezhonghuizishengchuyixiexijunhuomeijun，congerdusaigudingxiangkelijiandekongxi。tebieshiduiyuduoyuanzidongbilihunhedegaoxiaoyexiangsepuyilaishuo,水相或緩衝鹽相獨立貯存，因存放時間較長而容易發生此類問題。3.流動相純度目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑範圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。4.其它因素
如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質會破壞矽膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質會破壞化學鍵合矽膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
樣品因素1.樣(yang)品(pin)的(de)溶(rong)解(jie)性(xing)樣(yang)品(pin)試(shi)樣(yang)在(zai)配(pei)製(zhi)中(zhong)，如(ru)有(you)少(shao)量(liang)微(wei)粒(li)未(wei)能(neng)完(wan)全(quan)溶(rong)解(jie)，則(ze)會(hui)隨(sui)試(shi)樣(yang)一(yi)起(qi)進(jin)入(ru)色(se)譜(pu)柱(zhu)，同(tong)樣(yang)，會(hui)沉(chen)積(ji)在(zai)柱(zhu)頭(tou)處(chu)，造(zao)成(cheng)色(se)譜(pu)柱(zhu)的(de)堵(du)塞(sai)。
2.樣品的純度
樣(yang)品(pin)中(zhong)可(ke)能(neng)含(han)有(you)待(dai)分(fen)析(xi)組(zu)分(fen)以(yi)外(wai)的(de)各(ge)種(zhong)組(zu)分(fen)或(huo)雜(za)質(zhi)，這(zhe)些(xie)組(zu)分(fen)或(huo)雜(za)質(zhi)可(ke)能(neng)會(hui)在(zai)柱(zhu)內(nei)產(chan)生(sheng)不(bu)可(ke)逆(ni)吸(xi)附(fu)，從(cong)而(er)，使(shi)固(gu)定(ding)相(xiang)的(de)活(huo)性(xing)點(dian)被(bei)覆(fu)蓋(gai)，保(bao)留(liu)特(te)性(xing)發(fa)生(sheng)變(bian)化(hua)。
3.樣yang品pin的de化hua學xue性xing質zhi待dai測ce試shi樣yang中zhong的de各ge種zhong組zu分fen與yu填tian料liao之zhi間jian應ying具ju有you化hua學xue穩wen定ding性xing，比bi較jiao典dian型xing的de是shi在zai使shi用yong氨an基ji鍵jian合he柱zhu時shi，應ying避bi免mian使shi用yong含han羰tang基ji的de化hua合he物wu和he流liu動dong相xiang，如ru，丙bing酮tong、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮發發希夫(Schiff)縮合而使固定相破壞。
其它因素
影ying響xiang色se譜pu柱zhu壽shou命ming的de因yin素su很hen多duo，除chu流liu動dong相xiang和he樣yang品pin因yin素su外wai，還hai有you其qi它ta一yi些xie外wai在zai因yin素su，如ru，柱zhu壓ya的de影ying響xiang，溫wen度du的de影ying響xiang，色se譜pu柱zhu的de正zheng確que衝chong洗xi，色se譜pu柱zhu的de正zheng確que安an裝zhuang等deng。
色se譜pu柱zhu出chu現xian問wen題ti的de解jie決jue辦ban法fa色se譜pu柱zhu在zai使shi用yong中zhong最zui常chang見jian的de問wen題ti就jiu是shi柱zhu壓ya升sheng高gao，如ru果guo柱zhu壓ya是shi在zai長chang時shi間jian使shi用yong過guo程cheng中zhong緩huan慢man增zeng加jia，屬shu於yu正zheng常chang現xian象xiang。但dan柱zhu壓ya在zai使shi用yong過guo程cheng中zhong突tu然ran升sheng高gao（係統管路堵塞及壓力傳感器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
1.色譜柱頭的過濾篩板堵塞或汙染。
解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被汙染，可以將色譜柱反方向用甲醇衝洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內超聲清洗10分鍾，後再用純水超聲10分鍾，重新裝入色譜柱。
2.色譜柱頭的填料被樣品汙染。
解決方法：如(ru)確(que)定(ding)色(se)譜(pu)柱(zhu)頭(tou)的(de)填(tian)料(liao)被(bei)汙(wu)染(ran)，將(jiang)柱(zhu)頭(tou)螺(luo)絲(si)卸(xie)下(xia)，挖(wa)出(chu)柱(zhu)內(nei)前(qian)段(duan)被(bei)汙(wu)染(ran)的(de)填(tian)料(liao)，用(yong)相(xiang)同(tong)的(de)柱(zhu)填(tian)料(liao)重(zhong)新(xin)填(tian)入(ru)，仔(zai)細(xi)修(xiu)複(fu)後(hou)，重(zhong)新(xin)安(an)裝(zhuang)上(shang)柱(zhu)頭(tou)螺(luo)絲(si)。
3.色譜柱內緩衝液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出。
解決方法：如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水衝洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
4.流動相pH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。解決方法：如果因pH值使用不當，很難恢複。
色譜柱的八大注意事項
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會衝動柱內填料，因此，在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
2.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
3.一般說來色譜柱不能反衝，隻有生產者指明該柱可以反衝時，才可以反衝除去留在柱頭的雜質。否則反衝會迅速降低柱效。
4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以yi避bi免mian固gu定ding相xiang被bei破po壞huai。有you時shi可ke以yi在zai進jin樣yang器qi前qian麵mian連lian接jie一yi預yu柱zhu，分fen析xi柱zhu是shi鍵jian合he矽gui膠jiao時shi，預yu柱zhu為wei矽gui膠jiao，可ke使shi流liu動dong相xiang在zai進jin入ru分fen析xi柱zhu之zhi前qian預yu先xian被bei矽gui膠jiao“飽和”，避免分析柱中的矽膠基質被溶解。
5.經jing常chang用yong強qiang溶rong劑ji衝chong洗xi色se譜pu柱zhu，清qing除chu保bao留liu在zai柱zhu內nei的de雜za質zhi。在zai進jin行xing清qing洗xi時shi，對dui流liu路lu係xi統tong中zhong流liu動dong相xiang的de置zhi換huan應ying以yi相xiang混hun溶rong的de溶rong劑ji逐zhu漸jian過guo渡du，每mei種zhong流liu動dong相xiang的de體ti積ji應ying是shi柱zhu體ti積ji的de20倍左右。
6.保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發幹燥。絕對禁止將緩衝溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被汙染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在後兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔淨小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被汙染填料取淨)再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理後柱效能得到改善，但是很難恢複到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以矽膠為基質的填料，隻能在pH=2～9範圍內使用。柱子使用一段時間後，可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。
8.新(xin)的(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)在(zai)使(shi)用(yong)一(yi)段(duan)時(shi)間(jian)後(hou)柱(zhu)頂(ding)填(tian)料(liao)可(ke)能(neng)塌(ta)陷(xian)，使(shi)柱(zhu)效(xiao)下(xia)降(jiang)，這(zhe)時(shi)也(ye)可(ke)補(bu)加(jia)填(tian)料(liao)使(shi)柱(zhu)效(xiao)恢(hui)複(fu)。每(mei)次(ci)工(gong)作(zuo)完(wan)後(hou)，最(zui)好(hao)用(yong)洗(xi)脫(tuo)能(neng)力(li)強(qiang)的(de)洗(xi)脫(tuo)液(ye)衝(chong)洗(xi)，例(li)如(ru)，ODS柱宜用甲醇衝洗至基線平衡。當采用鹽緩衝溶液作流動相時，使用完後應用無鹽流動相衝洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不鏽鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機衝洗15分鍾。
色譜柱不使用時應該怎樣保存？
如果色譜柱不使用，又該如何進行保存呢？下列方法可供參考：
在zai柱zhu二er端duan包bao起qi來lai，放fang到dao盒he子zi裏li室shi溫wen避bi光guang保bao存cun。毛mao細xi管guan柱zhu可ke以yi用yong廢fei舊jiu的de隔ge墊dian裁cai成cheng二er塊kuai，分fen別bie插cha在zai毛mao細xi管guan二er段duan。填tian充chong柱zhu用yong小xiao塑su料liao袋dai套tao住zhu，再zai用yong細xi金jin屬shu絲si紮zha起qi來lai。因yin為wei分fen析xi室shi有you許xu多duo化hua學xue試shi劑ji，特te別bie在zai櫥chu內nei會hui有you些xie氣qi味wei，這zhe樣yang能neng較jiao好hao保bao管guan色se譜pu柱zhu。放fang置zhi時shi也ye要yao有you序xu放fang置zhi，毛mao細xi管guan柱zhu還hai是shi用yong盒he子zi裝zhuang好hao以yi免mian壓ya壞huai，在zai放fang置zhi時shi在zai柱zhu上shang和he記ji錄lu本ben上shang都dou做zuo好hao記ji錄lu。
chaixiahou，liangtouyongxiangjiaodianmifeng，xiangjiaodianyuanbensepuhezijiudaiyou，ruguomeiyou，yongjinyangdianzhizuoyixiajiukeyile，ranhouzhuangzaiyuanlaidesepuhezilimian，beizhushangxiangyingdexinxi。tongchangyaoqiufangzaiganzaodedifang，xiacishiyongshi，qiejijinyangduanhechukouduanbunengzhuangfan。
高效液相色譜柱的正確使用1.加裝保護柱
保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現在的色譜儀在流動相吸入口、進樣閥後部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器隻能除去不溶性顆粒而不能除去化學汙然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等複雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱必不可少的措施。
保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品,經過一定次數的樣品分析(50～100次)後,出現柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。
2.過濾流動相和樣品
流動相通常由水或緩衝溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經過色譜柱的流動相均應過濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質量且沒有受到汙染時,過濾並無更多實際意義。
當流動相中含有緩衝鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩衝溶液放置一段時間(視環境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)後,在使用前還應重新過濾。
所配製的樣品試液在注入流路係統前均要經0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區分水係和油係,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成汙染。裝流動相的容器和色譜係統中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。3.淨化樣品當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產生永久性吸附的蛋白質、糖等有機分子和強吸附性物質,以及可能對柱填料產生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多餘雜質組分。4.避免過高的柱壓
雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是：
(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。
(2)當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。
(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快。否則
超過20%的壓力衝擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯用時,柱切換要避免在高壓下進行。
5.注意溫度和酸堿度
一般以矽膠為基質的色譜柱最高使用溫度不超過60℃，以低於40℃為宜，特別是在流動相pH接(jie)近(jin)使(shi)用(yong)限(xian)度(du)時(shi)，更(geng)應(ying)降(jiang)低(di)使(shi)用(yong)溫(wen)度(du)。溫(wen)度(du)過(guo)高(gao)會(hui)加(jia)快(kuai)鍵(jian)合(he)相(xiang)的(de)水(shui)解(jie)和(he)矽(gui)膠(jiao)的(de)溶(rong)解(jie)，從(cong)而(er)，使(shi)填(tian)料(liao)性(xing)質(zhi)改(gai)變(bian)，柱(zhu)床(chuang)塌(ta)陷(xian)，降(jiang)低(di)柱(zhu)效(xiao)，改(gai)變(bian)峰(feng)形(xing)。目(mu)前(qian)的(de)鍵(jian)合(he)矽(gui)膠(jiao)色(se)譜(pu)柱(zhu)標(biao)示(shi)的(de)pH適用範圍可達2～10,但在實際使用時應避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害：
（1）在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相；
（2）降低使用溫度；
（3）檢驗完畢後立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗；
6.正確及時的衝洗
開始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對於新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是唯一能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。反相鍵合矽膠柱適宜的保存環境是純甲醇,如分析用流動相為緩衝液和有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相，以防止在柱內發生鹽的沉澱；試驗結束後,要及時用適當的溶劑衝洗係統並最終過渡到純甲醇衝洗,對dui於yu含han有you緩huan衝chong鹽yan的de流liu動dong相xiang，最zui好hao的de辦ban法fa是shi先xian用yong與yu分fen析xi用yong流liu動dong相xiang組zu成cheng完wan全quan相xiang同tong但dan不bu含han緩huan衝chong鹽yan的de溶rong液ye進jin行xing衝chong洗xi，再zai逐zhu步bu過guo渡du到dao純chun甲jia醇chun衝chong洗xi。多duo數shu衝chong洗xi液ye體ti積ji大da約yue為wei柱zhu容rong積ji的de15～20倍,但最終要以基線是否平直、壓力是否穩定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的最低使用濃度為≥5%,使用時應給予注意。
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