熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板係統和光學係統等主要部件組成，利用一定波長的光激發標本發射熒光
，通過物鏡和目鏡係統放大以觀察標本的熒光圖像。

　　一、熒光顯微鏡主要部件

　　（一）光源

　　現在多采用200W的(de)超(chao)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)作(zuo)光(guang)源(yuan)
，它(ta)是(shi)用(yong)石(shi)英(ying)玻(bo)璃(li)製(zhi)作(zuo)，中(zhong)間(jian)呈(cheng)球(qiu)形(xing)
，內(nei)充(chong)一(yi)定(ding)數(shu)量(liang)的(de)汞(gong)，工(gong)作(zuo)時(shi)由(you)兩(liang)個(ge)電(dian)極(ji)間(jian)放(fang)電(dian)，引(yin)起(qi)水(shui)銀(yin)蒸(zheng)發(fa)
，球(qiu)內(nei)氣(qi)壓(ya)迅(xun)速(su)升(sheng)高(gao)，當(dang)水(shui)銀(yin)完(wan)全(quan)蒸(zheng)發(fa)時(shi)，可(ke)達(da)50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超chao高gao壓ya汞gong燈deng的de發fa光guang是shi電dian極ji間jian放fang電dian使shi水shui銀yin分fen子zi不bu斷duan解jie離li和he還hai原yuan過guo程cheng中zhong發fa射she光guang量liang子zi的de結jie果guo。它ta發fa射she很hen強qiang的de紫zi外wai和he藍lan紫zi光guang，足zu以yi激ji發fa各ge類lei熒ying光guang物wu質zhi，因yin此ci，為wei熒ying光guang顯xian微wei鏡jing普pu遍bian采cai用yong。

　　超高壓汞燈也散發大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。

　　新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間後
，則需要高壓啟動（約為15000V），啟動後
，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短

，則壽命愈短，如開一次隻工作20min，則壽命降低50%。yinci，shiyongshijinliangjianshaoqidongcishu。dengpaozaishiyongguochengzhong，qiguangxiaoshizhujianjiangdide。dengximiehouyaodengdailengquecainengzhongxinqidong。dianrandengpaohoubukelijiguanbi，yimianshuiyinzhengfabuwanquanersunhuaidianji
，yibanxuyaodeng15min。由於超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。

　　超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓
、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的係統，燈泡球部後麵安裝有鍍鋁的凹麵反射鏡，前麵安裝有集光透鏡。

　　國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上
，價格也比較低。

　　我國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易於攜帶
，使用方便
，已推廣應用。

　　（二）濾色係統

　　濾(lv)色(se)係(xi)統(tong)是(shi)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)重(zhong)要(yao)部(bu)位(wei)，由(you)激(ji)發(fa)濾(lv)板(ban)和(he)壓(ya)製(zhi)濾(lv)板(ban)組(zu)成(cheng)。濾(lv)板(ban)型(xing)號(hao)，各(ge)廠(chang)家(jia)名(ming)稱(cheng)常(chang)不(bu)統(tong)一(yi)。濾(lv)板(ban)一(yi)般(ban)都(dou)以(yi)基(ji)本(ben)色(se)調(tiao)命(ming)名(ming)，前(qian)麵(mian)字(zi)母(mu)代(dai)表(biao)色(se)調(tiao)，後(hou)麵(mian)字(zi)母(mu)代(dai)表(biao)玻(bo)璃(li)，數(shu)字(zi)代(dai)表(biao)型(xing)號(hao)特(te)點(dian)。如(ru)德(de)國(guo)產(chan)品(pin)（Schott）BG12，就是種藍色玻璃

，B是藍色的第一個字母

，G是玻璃的第一個字母;我國產品的名稱已統一用拚音字母表示，如相當於BG12的藍色濾板名為QB24，Q是青色（藍色）拚音的第一個字母，B是玻璃拚音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530
，就是表示壓製濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當於BG12。

　　1.激發濾板

　　根據光源和熒光色素的特點
，可選用以下3類激發濾板
，提供一定波長範圍的激發光：

　　紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38
，以除去紅色尾波。

　　紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3
，外加BG-38。

　　紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24（BG12）。

　　最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板（如B-7）激發。

　　近年開始采用金屬膜幹涉濾板
，由於針對性強
，波長適當，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板
，均遠比玻璃濾板效果好。

　　激發濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

　　2.壓製濾板

　　壓製濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應濾長範圍的熒光。與激發濾板相對應
，常用以下3種壓製濾板：

　　紫外光壓製濾板：可通過可見光
、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

　　紫藍光壓製濾板：能通過510nm以上濾長的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

　　紫外紫光壓製濾板：能通過460nm以上波長的熒光（藍到紅）
，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。

　　（三）反光鏡

　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的
，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射隻有70%;一般使用平麵反光鏡。

　　（四）聚光鏡

　　專(zhuan)為(wei)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)設(she)計(ji)製(zhi)作(zuo)的(de)聚(ju)光(guang)器(qi)是(shi)用(yong)石(shi)英(ying)玻(bo)璃(li)或(huo)其(qi)他(ta)透(tou)紫(zi)外(wai)光(guang)的(de)玻(bo)璃(li)製(zhi)成(cheng)。分(fen)明(ming)視(shi)野(ye)聚(ju)光(guang)器(qi)的(de)暗(an)視(shi)野(ye)聚(ju)光(guang)器(qi)兩(liang)種(zhong)。還(hai)有(you)相(xiang)差(cha)熒(ying)光(guang)聚(ju)光(guang)器(qi)。

　　1.明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適於低

、中倍放大的標本觀察。

　　2.暗an視shi野ye聚ju光guang器qi暗an視shi野ye聚ju光guang器qi在zai熒ying光guang顯xian微wei鏡jing中zhong的de應ying用yong日ri益yi廣guang泛fan。因yin為wei激ji發fa光guang不bu直zhi接jie進jin入ru物wu鏡jing，因yin而er除chu散san射she光guang外wai，激ji發fa光guang也ye不bu進jin入ru目mu鏡jing
，可ke以yi使shi用yong薄bo的de激ji發fa濾lv板ban
，增zeng強qiang激ji發fa光guang的de強qiang度du，壓ya製zhi濾lv板ban也ye可ke以yi很hen薄bo，因yin紫zi外wai光guang激ji發fa時shi

，可ke用yong無wu色se濾lv板ban（不透過紫外）而er仍reng然ran產chan生sheng黑hei暗an的de背bei景jing。從cong而er增zeng強qiang了le熒ying光guang圖tu像xiang的de亮liang度du和he反fan襯chen度du
，提ti高gao了le圖tu像xiang的de質zhi量liang，觀guan察cha舒shu適shi，可ke能neng發fa現xian亮liang視shi野ye難nan以yi分fen辨bian的de細xi微wei熒ying光guang顆ke粒li。

　　3.相xiang差cha熒ying光guang聚ju光guang器qi相xiang差cha聚ju光guang器qi與yu相xiang差cha物wu鏡jing配pei合he使shi用yong，可ke同tong時shi進jin行xing相xiang差cha和he熒ying光guang聯lian合he觀guan察cha，既ji能neng看kan到dao熒ying光guang圖tu像xiang，又you能neng看kan到dao相xiang差cha圖tu像xiang，有you助zhu於yu熒ying光guang的de定ding位wei準zhun確que。一yi般ban熒ying光guang觀guan察cha很hen少shao需xu要yao這zhe種zhong聚ju光guang器qi。

　　（五）物鏡

　　各種物鏡均可應用
，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長範圍）shiheyuyingguang。youyutuxiangzaixianweijingshiyezhongdeyingguangliangduyuwujingjingkoulvdepingfangchengzhengbi，eryuqifangdabeishuchengfanbi

，suoyiweiletigaoyingguangtuxiangdeliangdu，yingshiyongjingkoulvdadewujing。youqizaigaobeifangdashiqiyingxiangfeichangmingxian。yinciduiyingguangbugouqiangdebiaoben，yingshiyongjingkoulvdadewujing
，peiheyijinkenengdidemujing（4×，5×，6.3×等）。

　　（六）目鏡

　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上
，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

　　（七）落射光裝置

　　新型的落射光裝置是從光源來的光射到幹涉分光濾鏡後，波長短的部分（紫外和紫藍）由於濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡
，經物鏡射向標本，使標本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時
，濾長長的部分（綠、黃
、紅等）
，duilvjingshiketoude
，yinci，buxiangwujingfangxiangfanshe，lvjingqilejifalvbanzuoyong，youyubiaobendeyingguangchuzaikejianguangchangboqu

，ketouguolvjingerdaodamujingguancha，yingguangtuxiangdeliangdusuizhefangdabeishuzengdaertigao

，zaigaofangdashibitousheguangyuanqiang。tachujuyoutousheshiguangyuandegongnengwai
，gengshiyongyubutoumingjibantoumingbiaoben
，ruhoupian

、濾膜
、菌落、組織培養標本等的直接觀察。近年研製的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。

　　二
、熒光顯微鏡標本製作要求

　　（一）載玻片

　　載玻片厚度應在0.8～1.2mm之(zhi)間(jian)，太(tai)厚(hou)的(de)坡(po)片(pian)


，一(yi)方(fang)麵(mian)光(guang)吸(xi)收(shou)多(duo)，另(ling)一(yi)方(fang)麵(mian)不(bu)能(neng)使(shi)激(ji)發(fa)光(guang)在(zai)標(biao)本(ben)上(shang)聚(ju)集(ji)。載(zai)玻(bo)片(pian)必(bi)須(xu)光(guang)潔(jie)，厚(hou)度(du)均(jun)勻(yun)，無(wu)明(ming)顯(xian)自(zi)發(fa)熒(ying)光(guang)。有(you)時(shi)需(xu)用(yong)石(shi)英(ying)玻(bo)璃(li)載(zai)玻(bo)片(pian)。

　　（二）蓋玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光
，也可用幹涉蓋玻片

，這是一種特製的表麵鍍有若幹層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質（如氟化鎂）的蓋玻片
，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光女可激發標本。

　　（三）標本

　　zuzhiqiepianhuoqitabiaobenbunengtaihou，rutaihoujifaguangdabufenxiaohaozaibiaobenxiabu
，erwujingzhijieguanchadaodeshangbubuchongfenjifa。lingwai，xibaozhongdiehuozazhiyangai

，yingxiangpanduan。

　　（四）封裱劑

　　封裱劑常用甘油，必須無自發熒光
，無色透明
，熒光的亮度在pH等於8.5～9.5時較亮
，不易很快褪去。所以
，常用甘油和0.5mol/L、pH為9.0～9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。

　　（五）鏡油

　　一yi般ban暗an視shi野ye熒ying光guang顯xian微wei鏡jing和he用yong油you鏡jing觀guan察cha標biao本ben時shi，必bi須xu使shi用yong鏡jing油you，最zui好hao使shi用yong特te製zhi的de無wu熒ying光guang鏡jing油you，也ye可ke用yong上shang述shu甘gan油you代dai替ti，液ye體ti石shi蠟la也ye可ke用yong，隻zhi是shi折zhe光guang率lv較jiao低di
，對dui圖tu像xiang質zhi量liang略lve有you影ying響xiang。

　　三、使用熒光顯微鏡的注意事項

　　（1）嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　　（2）應在暗室中進行檢查。進入暗室後
，接上電源

，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後，眼睛完全適應暗室
，再開始觀察標本。

　　（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

　　（4）檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min後
，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過2～3h。

　　（5）yingguangxianweijingguangyuanshoumingyouxian，biaobenyingjizhongjianzha，yijieshengshijian，baohuguangyuan。tianreshi，yingjiadianshansanrejiangwen，xinhuandengpaoyingcongkaishijiujilushiyongshijian。dengximiehouyuzaiyongshi，xudaidengpaochongfenlengquehoucainengdianran。yitianzhongyingbimianshucidianranguangyuan。

　　（6）標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存

，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

　　（7）熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”——無或可見微弱熒光。“+”——僅能見明確可見的熒光。“++”——可見有明亮的熒光。“+++”——可見耀眼的熒光。

　　四
、熒光圖像的記錄方法

　　熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)所(suo)看(kan)到(dao)的(de)熒(ying)光(guang)圖(tu)像(xiang)，一(yi)是(shi)具(ju)有(you)形(xing)態(tai)學(xue)特(te)征(zheng)，二(er)是(shi)具(ju)有(you)熒(ying)光(guang)的(de)顏(yan)色(se)和(he)亮(liang)度(du)，在(zai)判(pan)斷(duan)結(jie)果(guo)時(shi)，必(bi)須(xu)將(jiang)二(er)者(zhe)結(jie)合(he)起(qi)來(lai)綜(zong)合(he)判(pan)斷(duan)。結(jie)果(guo)記(ji)錄(lu)根(gen)據(ju)主(zhu)觀(guan)指(zhi)標(biao)，即(ji)憑(ping)工(gong)作(zuo)者(zhe)目(mu)力(li)觀(guan)察(cha)。作(zuo)為(wei)一(yi)般(ban)定(ding)性(xing)觀(guan)察(cha)
，基(ji)本(ben)上(shang)可(ke)靠(kao)的(de)。隨(sui)著(zhe)技(ji)術(shu)科(ke)學(xue)的(de)發(fa)展(zhan)，在(zai)不(bu)同(tong)程(cheng)度(du)上(shang)采(cai)用(yong)客(ke)觀(guan)指(zhi)標(biao)記(ji)錄(lu)判(pan)斷(duan)結(jie)果(guo)，如(ru)用(yong)細(xi)胞(bao)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)，圖(tu)像(xiang)分(fen)析(xi)儀(yi)等(deng)儀(yi)器(qi)。但(dan)這(zhe)些(xie)儀(yi)器(qi)記(ji)錄(lu)的(de)結(jie)果(guo)，也(ye)必(bi)須(xu)結(jie)合(he)主(zhu)觀(guan)的(de)判(pan)斷(duan)。

　　yingguangxianweijingsheyingjishuduiyujiluyingguangtuxiangshifenbiyao，youyuyingguanghenyituisejianruo，yaojishisheyingjilujieguo。fangfayuputongxianweisheyingjishujibenxiangtong。zhishixuyaocaiyonggaosuganguangjiaopianruASA200以上。因紫外光對熒光猝滅作用大
，如FITC的標記物
，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。suoyi
，puguangsudutaiman，jiubunengjiangyingguangtuxiangpaishexialai。yibanyanjiuxingyingguangxianweijingdouyoubanzidonghuoquanzidongxianweisheyingxitongzhuangzhi。biaobendezhizuofangfayangpinxujingguoshilabaomaiqiepian，ranhouyongtiefansumujingranse
，putongguangjingguanchaxiaoguohaikeyi。