激光掃描共聚焦顯微鏡與圖像半定量分析相比,具有以下優點:
1.更精細、精(jing)確(que)度(du)更(geng)高(gao)。激(ji)光(guang)掃(sao)描(miao)共(gong)聚(ju)焦(jiao)顯(xian)微(wei)鏡(jing)對(dui)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)組(zu)織(zhi)化(hua)學(xue)染(ran)色(se)樣(yang)品(pin)做(zuo)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)時(shi),利(li)用(yong)激(ji)光(guang)聚(ju)焦(jiao)和(he)係(xi)統(tong)軟(ruan)件(jian)分(fen)析(xi)對(dui)組(zu)織(zhi)進(jin)行(xing)深(shen)層(ceng)掃(sao)描(miao),不(bu)破(po)壞(huai)組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)結(jie)構(gou),可(ke)深(shen)層(ceng)次(ci)準(zhun)確(que)定(ding)位(wei)並(bing)精(jing)確(que)定(ding)量(liang)。而(er)一(yi)般(ban)圖(tu)像(xiang)分(fen)析(xi)隻(zhi)是(shi)以(yi)熒(ying)光(guang)灰(hui)度(du)的(de)差(cha)別(bie)變(bian)化(hua)進(jin)行(xing)半(ban)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)。
2.jiguangsaomiaogongjujiaoxianweijingyibanyoulianggeyishangbutongbochangdejiguangguan,zhiyaojiangbiaobenbiaojishangbutongbochangdeyingguang,jiukeyizaitongyizhangqiepianshangtongshifenxiliangzhonghuogengduobutongzhibiaodebianhua,bingbijiaotamenzhijiandebizhibianhua,jingqueeryoufangbian,zheyitedianshiyibantuxiangfenxiwufabinide。
3.激光掃描共聚焦顯微鏡可根據需要提供純熒光、白光以及熒光與白光合成圖像等多種圖像,遠遠優於一般圖像分析。
4.yiwangmianyiyingguangranseduoyaoqiubingdongxinxianzuzhibiaoben,yongshilaqiepianzaiputongyingguangxianweijingxiaguancha,changyinbeijingfeiteyixingyingguangguoqiangyingxiangguanchajieguo。ershilabiaobenlaiyuanguangfan,shiyongyuhuiguxingyanjiu。jiguangsaomiaogongjujiaoxianweijingkesaomiaoshilaqiepiandeyingguangranse,kebimianyinbeijingfeiteyixingyingguangguoqiangeryingxiangguanchajieguo,congerkehuodeqingxituxiang,zheyeshijiguangsaomiaogongjujiaoxianweijingdeyoushisuozai。
激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項
一、製備高特異性和高效價的熒光抗體
標本隻有在用熒光探針標記的前提下才能進行共聚焦顯微鏡檢測.zhibeigaoteyixinghegaoxiaojiadeyingguangkangtishijiancedeguanjian。zhejiuyaoqiuxuanyonggaozhiliangdeyingguangsuhegaoteyixingyugaoxiaojiademianyixueqing。tongshihaiyaoduiyingguangkangtijinxingzhiliangjianding,zhuyaoshijinxingteyixingheminganxingjianding。
二、標本製作要求
1.標本厚度 組織切片或其他標本不能太厚,否則激發光多數消耗在標本下部,而物鏡觀察的上部不能被充分激發。
2.載玻片 載玻片要光潔,無自發熒光;載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間,太厚會吸收較多的光,不能使激發光在標本上聚焦。
3.封固劑 甘油必須無色透明,無自發熒光。由於熒光在pH 8.5~9.5時較亮,不易很快退去,常用甘油加入0.5mol/lpH 9.0~9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液封片。
三、定量研究的要求
1.隨機性
(1)在感興趣區域內隨機抽樣,不能主觀地選擇一些便於定量的“理想切片”,這種“理想切片”不能代表所要研究的整體區域。
(2)在隨機抽取的切片上,應隨機抽取觀察視野。
(3)在隨機抽取的視野中,通過連續觀察“光學切片”,得到感興趣結構的三維定量信息。如果不能連續觀察“光學切片”,需要在Z軸方向隨機抽樣,然後作定量研究。
2.避免參照陷阱 如果獲得的資料是密度信息,當比較各組參照空間(包含待測結構的區域)的體積不同時,根據密度信息可能得出錯誤結論。因此,需要注意所謂的參照空間“陷阱”問題。
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