一、構造原理及結構

72型分光光度計是可見光分光光度計，波長範圍為420nm～700nm，它由三大部分組 成:磁飽和穩壓器、光源、單色光器和測光機構、微電計。
72型分光光度計的基本依據是朗伯—比耳定律，它是根據相對測量原理工作的，即先選定某一溶劑作為標準溶液，設定其透光率為100%，被(bei)測(ce)試(shi)樣(yang)的(de)透(tou)光(guang)率(lv)是(shi)相(xiang)對(dui)於(yu)標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)而(er)言(yan)的(de)
，即(ji)讓(rang)單(dan)色(se)光(guang)分(fen)別(bie)通(tong)過(guo)被(bei)測(ce)試(shi)樣(yang)和(he)標(biao)準(zhun)溶(rong)液(ye)


，二(er)者(zhe)能(neng)量(liang)的(de)比(bi)值(zhi)就(jiu)是(shi)在(zai)一(yi)定(ding)波(bo)長(chang)下(xia)對(dui)於(yu)被(bei)測(ce)試(shi)樣(yang)的(de)透(tou)光(guang)率(lv)。如(ru)圖(tu)所(suo)示(shi)，白(bai)色(se)光(guang)源(yuan)經(jing)入(ru)射(she)狹(xia)縫(feng)、反射鏡和透光鏡後，變成平行光進入棱鏡，色散後的單色光經鍍鋁的反射鏡反射後，再經過透鏡並聚光於出射狹縫上

，狹縫寬度為0.32nm。fanshejinghelengjingzuzhuangzaiyikexuanzhuandezhuanpanshangbingyoubochangtiaojieqidetulunsuodaidong，zhuandongbochangtiaojieqibiankeyizaichuguangxiafenghoumianxuanzedaorenyibochangdedanseguang。danseguangtouguoyangpinxishouchihouyouyiguangliangtiaojieqitiaojieweishidudeguangtongliang，zuihoubeiguangdiandianchixishou，zhuanhuanchengdianliuhouyouweidianjizhishi，congkedubiaochi 上直接讀出透光率的值。
 
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸
，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

二、分光光度計的簡單原理

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)采(cai)用(yong)一(yi)個(ge)可(ke)以(yi)產(chan)生(sheng)多(duo)個(ge)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)，通(tong)過(guo)係(xi)列(lie)分(fen)光(guang)裝(zhuang)置(zhi)，從(cong)而(er)產(chan)生(sheng)特(te)定(ding)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)源(yuan)，光(guang)源(yuan)透(tou)過(guo)測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)品(pin)後(hou)
，部(bu)分(fen)光(guang)源(yuan)被(bei)吸(xi)收(shou)
，計(ji)算(suan)樣(yang)品(pin)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)，從(cong)而(er)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度(du)。樣(yang)品(pin)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度(du)成(cheng)正(zheng)比(bi)。

1
、核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA
，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構成不一，因此其換算係數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。ceshihoudexiguangzhijingguoshangshuxishudehuansuan，congerdechuxiangyingdeyangpinnongdu。ceshiqian
，xuanzezhengquedechengxu，shuruyuanyehexishiyedetiji，erhouceshikongbaiyeheyangpinye。raner
，shiyanbingfeiyifanfengshun。dushubuwendingkenengshishiyanzhezuitoutongdewenti。lingminduyuegaodeyiqi，biaoxianchudexiguangzhipiaoyiyueda。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內變化
，即儀器有一定的準確度和精確度。如EppendorfBiophotometer的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移
，因此建議使用pH值一定
、離子濃度較低的緩衝液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由(you)於(yu)樣(yang)品(pin)中(zhong)不(bu)可(ke)避(bi)免(mian)存(cun)在(zai)一(yi)些(xie)細(xi)小(xiao)的(de)顆(ke)粒(li)
，尤(you)其(qi)是(shi)核(he)酸(suan)樣(yang)品(pin)。這(zhe)些(xie)小(xiao)顆(ke)粒(li)的(de)存(cun)在(zai)幹(gan)擾(rao)測(ce)試(shi)效(xiao)果(guo)。為(wei)了(le)最(zui)大(da)程(cheng)度(du)減(jian)少(shao)顆(ke)粒(li)對(dui)測(ce)試(shi)結(jie)果(guo)的(de)影(ying)響(xiang)，要(yao)求(qiu)核(he)酸(suan)吸(xi)光(guang)值(zhi)至(zhi)少(shao)大(da)於(yu)0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內，顆粒的幹擾相對較小，結果穩定。

從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈
；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯
；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A 280的比值，用於評估樣品的純度
，因為蛋白的吸收峰是 280 nm。純淨的樣品，比值大於 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A 230表示樣品中存在一些汙染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純淨的核酸 A 260 / A 230 的比值大於 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他幹擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。

2、蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg公式

，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。

蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩衝液中存在一些雜質，一般要消除320 nm的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似
，要求 A 280 的吸光值至少大於 0.1A，最佳的線性範圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上
，隻要觀察A 280的吸光值的變化範圍不超過 1%，表明結果非常穩定。
漂移的原因是因為 Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的係數，隻要吸光值有少許改變
，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。

蛋白質直接定量方法，適合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說
，速度快
，操作簡單
；但是容易受到平行物質的幹擾，如DNA 的幹擾
；另外敏感度低
，要求蛋白的濃度較高。

3、比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應
，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的 Biuret 反應為基礎

，並有所改進。蛋白質與Cu2+反應
，產生藍色的反應物。但是與 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA
，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液裏與Cu2+反應產生 Cu+，後者與 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物
，吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關係極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於 Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去汙劑的幹擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特點是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2倍；操作更簡單，速度更快；隻需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果
；而且與一係列幹擾 Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去汙劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。

某mou些xie初chu次ci接jie觸chu比bi色se法fa測ce定ding的de研yan究jiu者zhe可ke能neng為wei各ge種zhong比bi色se法fa測ce出chu的de結jie果guo並bing不bu一yi致zhi，感gan到dao迷mi惑huo
，究jiu竟jing該gai相xiang信xin哪na種zhong方fang法fa？由you於yu各ge種zhong方fang法fa反fan應ying的de基ji團tuan以yi及ji顯xian色se基ji團tuan不bu一yi，所suo以yi同tong時shi使shi用yong幾ji種zhong方fang法fa對dui同tong一yi樣yang品pin得de出chu的de樣yang品pin濃nong度du無wu可ke比bi性xing。例li如ru：Keller 等測試人奶中的蛋白，結果 Lowry，BCA測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以 BSA 作標準品
，濃度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作標準品，濃度 2.64 mg /ml。因yin此ci
，在zai選xuan擇ze比bi色se法fa之zhi前qian，最zui好hao是shi參can照zhao要yao測ce試shi的de樣yang本ben的de化hua學xue構gou成cheng
，尋xun找zhao化hua學xue構gou成cheng類lei似si的de標biao準zhun蛋dan白bai作zuo標biao準zhun品pin。另ling外wai，比bi色se法fa定ding量liang蛋dan白bai質zhi
，經jing常chang出chu現xian的de問wen題ti是shi樣yang品pin的de吸xi光guang值zhi太tai低di，導dao致zhi測ce出chu的de樣yang品pin濃nong度du與yu實shi際ji的de濃nong度du差cha距ju較jiao大da。關guan鍵jian問wen題ti是shi

，反fan應ying後hou的de顏yan色se是shi有you一yi定ding的de半ban衰shuai期qi
，所suo以yi每mei種zhong比bi色se法fa都dou列lie出chu了le反fan應ying測ce試shi時shi間jian，所suo有you的de樣yang品pin（包括標準樣品）
，都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小

，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PHzhidengdoushiyingxiangshiyandezhongyaoyuanyin。ciwai
，feichangzhongyaodeshi
，zuihaoshiyongsuliaodebisefa。bimianshiyongshiyinghuozhebolicaizhidebisebei，yinweifanyinghoudeyansehuirangshiyinghuozhebolizhese
，daozhiyangpinxiguangzhibuzhunque。

細菌細胞密度（OD 600）
實(shi)驗(yan)室(shi)確(que)定(ding)細(xi)菌(jun)生(sheng)長(chang)密(mi)度(du)和(he)生(sheng)長(chang)期(qi)，多(duo)根(gen)據(ju)經(jing)驗(yan)和(he)目(mu)測(ce)推(tui)斷(duan)細(xi)菌(jun)的(de)生(sheng)長(chang)密(mi)度(du)。在(zai)遇(yu)到(dao)要(yao)求(qiu)較(jiao)高(gao)的(de)實(shi)驗(yan)，需(xu)要(yao)采(cai)用(yong)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)準(zhun)確(que)測(ce)定(ding)細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)。OD600是(shi)追(zhui)蹤(zong)液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)物(wu)中(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)長(chang)的(de)標(biao)準(zhun)方(fang)法(fa)。以(yi)未(wei)加(jia)菌(jun)液(ye)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)作(zuo)為(wei)空(kong)白(bai)液(ye)，之(zhi)後(hou)定(ding)量(liang)培(pei)養(yang)後(hou)的(de)含(han)菌(jun)培(pei)養(yang)液(ye)。為(wei)了(le)保(bao)證(zheng)正(zheng)確(que)操(cao)作(zuo)，必(bi)須(xu)針(zhen)對(dui)每(mei)種(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)和(he)每(mei)台(tai)儀(yi)器(qi)用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)進(jin)行(xing)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)
，做(zuo)出(chu)校(xiao)正(zheng)曲(qu)線(xian)。實(shi)驗(yan)中(zhong)偶(ou)爾(er)會(hui)出(chu)現(xian)菌(jun)液(ye)的(de)ODzhichuxianfuzhi，yuanyinshicaiyonglexiansedepeiyangji，jixijunpeiyangyiduanshijianhou，yupeiyangjifanying，fashengbiansefanying。lingwai，xuyaozhuyideshi，ceshideyangpinbunenglixin，baochixijunxuanfuzhuangtai。

分光光度計的重要配件 —— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、玻(bo)璃(li)杯(bei)以(yi)及(ji)塑(su)料(liao)杯(bei)。根(gen)據(ju)不(bu)同(tong)的(de)測(ce)量(liang)體(ti)積(ji)，有(you)比(bi)色(se)杯(bei)和(he)毛(mao)細(xi)比(bi)色(se)杯(bei)等(deng)。一(yi)般(ban)測(ce)試(shi)核(he)酸(suan)和(he)紫(zi)外(wai)定(ding)量(liang)蛋(dan)白(bai)，均(jun)采(cai)用(yong)石(shi)英(ying)杯(bei)或(huo)者(zhe)玻(bo)璃(li)杯(bei)，但(dan)是(shi)不(bu)適(shi)合(he)比(bi)色(se)法(fa)測(ce)定(ding)。因(yin)為(wei)反(fan)應(ying)中(zhong)的(de)染(ran)料(liao)（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用於在紫外範圍內測試樣品。

由(you)於(yu)另(ling)外(wai)測(ce)試(shi)的(de)樣(yang)品(pin)量(liang)不(bu)同(tong)，所(suo)以(yi)一(yi)般(ban)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)廠(chang)家(jia)提(ti)供(gong)不(bu)同(tong)容(rong)積(ji)的(de)比(bi)色(se)杯(bei)以(yi)滿(man)足(zu)用(yong)戶(hu)不(bu)同(tong)的(de)需(xu)求(qiu)。目(mu)前(qian)市(shi)場(chang)已(yi)經(jing)存(cun)在(zai)一(yi)種(zhong)既(ji)可(ke)用(yong)於(yu)核(he)酸(suan)、紫外蛋白質定量，亦可用於蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?suliaobisebei
，shimuqianbisebeishichangshangyigegexin。suizheshengmingkexueyijixiangguanxuekefazhan，duicileikexuedeshiyanyanjiutichugenggaodeyaoqiu，fenguangguangdujijiangshifenzishengwuxueshiyanshibukequeshaodeyiqi，yechengweiweishengwu、食品、製藥等相關實驗室的必備設備之一。