豬尿中克倫特羅檢測方法—酶聯免疫吸附測定法

前言

克倫特羅為β—腎上腺素受體激動藥，是一種用於人治療哮喘、支氣管痙攣的藥物。研究發現在飼料中添加克倫特羅可促進動物生長、提高瘦肉率，特別是改進脂肪型動物的肉與脂肪的比例，豬飼用後生長速度快

，體型好，且瘦肉多、脂肪少
，被當作“瘦肉精”而成為一些飼料生產企業和養豬戶的“秘密武器”。但是克倫特羅進入豬體內後
，主要分布在肝等內髒器官，在體內代謝的時間較長，容易造成藥物在組織中殘留
，給消費者帶來危害
；健康的人在食用一定量的殘留有克倫特羅的豬肉或內髒後
，可能出現肌肉震顫、心慌、戰栗
、惡心、代謝紊亂、呼吸急促、煩躁不安等症狀。由於克倫特羅的性質穩定，能夠在豬尿中以原形排出
，因此製訂豬尿中克倫特羅的檢測方法，以監測“瘦肉精”的使用，顯得非常重要。

競爭酶標免疫法是非常有效的篩選方法

，可定量測定尿、肌肉
、肝髒及牛眼中的克倫特羅。此法快速簡便
、經濟實用
，較易掌握推廣。

本標準由江西省農業廳提出。

本標準由江西省獸藥飼料監察所負責起草。

本標準起草人：劉安南

、陳文雲
、萬文根

、徐國茂。

豬尿中克倫特羅檢測方法—酶聯免疫吸附測定法

1 範圍

本標準規定了豬尿中克倫特羅檢驗的製樣和酶聯免疫吸附測定方法。

本標準適用於豬尿中克倫特羅的殘留常規快速篩選及定量檢測。

2 測定方法

2.1 原理與方法

測(ce)定(ding)的(de)基(ji)礎(chu)是(shi)抗(kang)原(yuan)抗(kang)體(ti)反(fan)應(ying)。酶(mei)聯(lian)板(ban)包(bao)被(bei)有(you)克(ke)倫(lun)特(te)羅(luo)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)的(de)抗(kang)體(ti)，加(jia)入(ru)抗(kang)克(ke)倫(lun)特(te)羅(luo)的(de)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體(ti)，兩(liang)者(zhe)結(jie)合(he)被(bei)固(gu)定(ding)。標(biao)樣(yang)或(huo)試(shi)樣(yang)中(zhong)克(ke)倫(lun)特(te)羅(luo)與(yu)酶(mei)（辣根過氧化酶）標記抗原競爭抗克倫特羅的特異性抗體。通過洗滌以除去沒有與抗克倫特羅的特異性抗體結合的酶標記抗原。加入酶基質（過氧化尿素）和發色劑（四甲基聯苯胺）結合到酶聯板上的酶標記物將無色的發色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液後使顏色由藍色轉變為黃色。在450nm處測定吸光度值。吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比。

2.2 試劑、用途及儀器、設備

競爭酶標免疫法試劑盒可用於定量測定尿、肌肉、肝髒等中的克倫特羅。試劑盒中包括了所有檢測用的試劑


，在使用前，請詳細閱讀試劑盒說明書。定量分析須用微孔板酶標儀（450nm）進行測量。

2.2.1 克倫特羅係列標準溶液（0ng/L
，100 ng/L，300 ng/L，900 ng/L，2700 ng/L
，8100 ng/L）

2.2.2 酶標板

2.2.3 抗克倫特羅的特異性抗體

2.2.4 酶標記抗原

2.2.5 緩衝溶液

2.2.6 酶基質/發色劑

2.2.7 反應停止液（1mol/LH2SO4）

2.2.8 微孔板酶標儀（450nm）

2.2.9離心機

2.2.10微型振蕩器

2.2.11 微量加樣器（20μl，50μl，100μl
，200μl，250μl）

3 製樣

3.1 樣品的製備

取適量新鮮或冷凍空白或供試尿液
，如尿樣渾濁
，則必須2000g離心10min，取上清液留用。

3.2 樣品的保存

-20℃冰箱中貯存備用。

3.3 測定

測定之前將所有試劑回升至室溫20℃—24℃
，取解凍後的供試樣品
，2000g離心10min

，取上清液，作為供試液。

3.3.1 測定程序（室溫20℃—24℃條件下操作）

（1）將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗
，記錄下標準和樣品的位置。

（2）加入100μl稀釋後的抗體溶液到每一個微孔中底部
，在室溫孵育15min。

（3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次），以保證完全除去孔中的液體

，用250μl蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，重複操作兩遍以上。

（４）精密吸取２０μl標準溶液及處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。

（5）加入100μl稀釋的酶標記物到微孔底部
，在微型震蕩器上混勻，室溫孵育30min。

（6）重複步驟（3）。

（7）加入100μl基質/發色劑到微孔中
，在微量振蕩器上充分混勻（或小心地在平麵上轉動酶標板以充分混合）
，並在室溫暗處孵育15min。

（8）加入100μl反應停止液到微孔中
，混勻。在60min內450nm處以空氣為空白測定吸光度值。

3.3.2 結果判定和表述

按下式計算百分吸光度值：

百分吸光度值=B/B0×100%

式中：B—為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；

B0—為零標準的標準溶液平均吸光度值
；

以X軸為標準溶液中克倫特羅濃度（ng/L）的自然對數，Y軸為百分吸光度值，在半對數坐標紙上繪製標準曲線圖。從標準曲線上查出供試樣品中克倫特羅的濃度（ng/L）。也可以用專業計算機軟件求出供試樣品中克倫特羅的濃度。

檢測結果小於1000ng/L時判為未檢出，大於或等於1000ng/Lg時判為可疑，需要複檢後再確定。複檢後小於或等於1000ng/L為未檢出
，大於1000ng/L為陽性。尿液稀釋係數為1。