了解常規DNA序列分析技術(Sanger雙脫氧法)的原理及操作步驟。

實驗原理：

在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等(1977)發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和Gilbert(1977)發明的化學降解法。兩種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止
，產生A，T，C
，G四組不同長度的一係列核苷酸
，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。

Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚(ju)合(he)酶(mei)來(lai)延(yan)伸(shen)結(jie)合(he)在(zai)待(dai)定(ding)序(xu)列(lie)模(mo)板(ban)上(shang)的(de)引(yin)物(wu)。直(zhi)到(dao)摻(chan)入(ru)一(yi)種(zhong)鏈(lian)終(zhong)止(zhi)核(he)苷(gan)酸(suan)為(wei)止(zhi)。每(mei)一(yi)次(ci)序(xu)列(lie)測(ce)定(ding)由(you)一(yi)套(tao)四(si)個(ge)單(dan)獨(du)的(de)反(fan)應(ying)構(gou)成(cheng)
，每(mei)個(ge)反(fan)應(ying)含(han)有(you)所(suo)有(you)四(si)種(zhong)脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)酸(suan)三(san)磷(lin)酸(suan)(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G

、A
、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的de相xiang對dui濃nong度du可ke以yi調tiao整zheng，使shi反fan應ying得de到dao一yi組zu長chang幾ji百bai至zhi幾ji千qian堿jian基ji的de鏈lian終zhong止zhi產chan物wu。它ta們men具ju有you共gong同tong的de起qi始shi點dian，但dan終zhong止zhi在zai不bu同tong的de的de核he苷gan酸suan上shang
，可ke通tong過guo高gao分fen辨bian率lv變bian性xing凝ning膠jiao電dian泳yong分fen離li大da小xiao不bu同tong的de片pian段duan，凝ning膠jiao處chu理li後hou可ke用yongX-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

 

圖9-1 Sanger雙脫氧法DNA測序原理

自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產出373型
、377型
、310型、3700和3100型等DNA測序儀
，其中310型是社會上提供DNA測序服務的生物技術公司中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規程。

310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳
，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR

測序反應
，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chan)物(wu)可(ke)在(zai)一(yi)根(gen)毛(mao)細(xi)管(guan)內(nei)電(dian)泳(yong)，從(cong)而(er)避(bi)免(mian)了(le)泳(yong)道(dao)間(jian)遷(qian)移(yi)率(lv)差(cha)異(yi)的(de)影(ying)響(xiang)，大(da)大(da)提(ti)高(gao)了(le)測(ce)序(xu)的(de)精(jing)確(que)度(du)。由(you)於(yu)分(fen)子(zi)大(da)小(xiao)不(bu)同(tong)
，在(zai)毛(mao)細(xi)管(guan)電(dian)泳(yong)中(zhong)的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)也(ye)不(bu)同(tong)，當(dang)其(qi)通(tong)過(guo)毛(mao)細(xi)管(guan)讀(du)數(shu)窗(chuang)口(kou)段(duan)時(shi)，激(ji)光(guang)檢(jian)測(ce)器(qi)窗(chuang)口(kou)中(zhong)的(de)CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，並在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控製的測定DNA 片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一
，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置
、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器
，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。

由於該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能

，因此可進行DNA測序
、雜合子分析
、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析
，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析
、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。

實驗材料：

1、客戶端：

測序模板：可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。

A.含待測質粒DNA的菌液：細菌繁殖和質粒DNA抽提工作交給公司做。

B.或已提純的質粒DNA：客戶自己完成質粒DNA抽提工作。

C.或菌落PCR擴增產物：將待測序的DNA 片段用PCR擴增出來，作為提交給公司的模板。

測序引物：需根據所要測定的DNA 片段設計正向或反向引物，配製成3.2μmol/L
，即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

本實驗中使用GAPDH PCR擴增引物F2和R2：同實驗3。

2、公司端：

[1].BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩衝液等。

[2].pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L，試劑盒配套試劑。

[3].M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT

，3.2μmol/L
，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。

[4].DNA測序模板：可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。

[5].引物：需根據所要測定的DNA 片段設計正向或反向引物，配製成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

[6].滅菌去離子水或三蒸水。

[7].0.2ml或和0.5ml的PCR管：蓋體分離，PE公司產品。

[8].3mol/L 醋酸鈉(pH5.2)：稱取40.8g NaAc·3H2O溶於70ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100ml

，高壓滅菌後分裝。

[9].70%乙醇和無水乙醇。

[10].NaAc/乙醇混合液：取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。

[11].POP 6測序膠：ABI產品

[12].模板抑製試劑(TSR)：ABI產品

[13].10×電泳緩衝液：ABI產品

[14].ABI PRISM 310型全自動DNA測序儀

[15].2400型或9600型PCR儀

[16].台式冷凍高速離心機

[17].台式高速離心機或袖珍離心機

操作步驟：

1、PCR測序反應

[1].取0.2ml的PCR管

，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：

總反應體積5μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

[2].將PCR管置於9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2min後進行PCR循環
，PCR循環參數為96 10s℃，50 5s℃
，604min℃，25個循環
，擴增結束後設置4℃保溫。

2、 醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物

[1].將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5ml EP管中。

[2].加入25μl醋酸鈉/乙醇混合液
，充分振蕩
，置冰上10min以沉澱DNA。12 000r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。

[3].加70%(V/V)的乙醇50μl洗滌沉澱2次。12 000r/min於4℃離心5min，小心棄上清和管壁的液珠
，真空幹燥沉澱10～15min。

3、電泳前測序PCR產物的處理。

[1].加入12μl的TSR於離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉澱，稍離心。

[2].將溶液轉移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

[3].在PCR儀上進行熱變性(95 2min)℃，冰中驟冷，待上機。

4

、上機操作

[1].按儀器操作說明書安裝毛細管
，進行毛細管位置的校正
，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。

[2].儀器將自動灌膠至毛細管
，1.2kV預電泳5min
，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下電泳2h。

[3].

電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品
，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為2.5h。

[4].

電泳結束後儀器自動分析或打印出彩色測序圖譜。

5、序列分析：

儀(yi)器(qi)將(jiang)自(zi)動(dong)進(jin)行(xing)序(xu)列(lie)分(fen)析(xi)，並(bing)可(ke)根(gen)據(ju)用(yong)戶(hu)要(yao)求(qiu)進(jin)行(xing)序(xu)列(lie)比(bi)較(jiao)。如(ru)測(ce)序(xu)序(xu)列(lie)已(yi)知(zhi)，可(ke)通(tong)過(guo)序(xu)列(lie)比(bi)較(jiao)以(yi)星(xing)號(hao)標(biao)出(chu)差(cha)異(yi)堿(jian)基(ji)處(chu)，提(ti)高(gao)工(gong)作(zuo)效(xiao)率(lv)。

6
、測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。

[1].

測序反應精確度計算公式：100%－差異堿基數(不包括N數)/650×100%

[2].

差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。

7、向客戶提供報告

測序報告通常為一份大約650bp的彩色圖譜和一份大約800bp的序列。

注意事項：

[1].ABI PRISM 310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。

[2].本實驗測序PCR反應的總體積是5μl，而且未加礦物油覆蓋
，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑後蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束後PCR液小於4～4.5μl，則此PCR反應可能失敗
，不必進行純化和上樣。

[3].作為測序用戶來說，隻需提供純化好的DNA樣品和引物
，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少
，一般PCR產物需30～90ng
，單鏈DNA需50～100ng

，雙鏈DNA需200～500ng，DNA的純度一般是A260nm/A280nm為1.6～2.0，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩衝液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。

[4].本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環測序試劑盒
，一般可測DNA長度為650bp左右。

[5].本儀器DNA測序精確度為(98.5±0.5) %，儀器不能辨讀的堿基N＜2%，所需測定的長度超過了650bp，則需設計另外的引物。

[6].為保證測序更為準確，可設計反向引物對同一模板進行測序，相互印證。

[7].對於N堿基可進行人工核對，有時可以辨讀出來。

[8].為提高測序的精確度，根據星號提示位置
，可人工分析該處彩色圖譜，對該處堿基作進一步核對。

附：小鼠GAPDH mRNA 全長1002bp