研究方麵,稱作Nouthern印跡法。1979年Towbin等則把該方法擴展應用到蛋白質分析方麵,稱作Western印跡法。1982年Reinhart報道的雙向蛋白質印跡法,稱作Eastern印跡法。目前,有人把Southern,Nouthern,Western印跡法分別稱作DNA印跡法,RNA印(yin)跡(ji)法(fa)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)印(yin)跡(ji)法(fa)。而(er)每(mei)一(yi)種(zhong)印(yin)跡(ji)法(fa)又(you)可(ke)以(yi)分(fen)為(wei)斑(ban)點(dian)印(yin)跡(ji)法(fa)和(he)電(dian)泳(yong)轉(zhuan)移(yi)印(yin)跡(ji)法(fa)。前(qian)者(zhe)是(shi)將(jiang)樣(yang)品(pin)直(zhi)接(jie)吸(xi)附(fu)於(yu)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang),而(er)後(hou)者(zhe)則(ze)是(shi)將(jiang)樣(yang)品(pin)先(xian)經(jing)過(guo)電(dian)泳(yong)後(hou)在(zai)轉(zhuan)移(yi)到(dao)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)表(biao)麵(mian)上(shang),其(qi)餘(yu)操(cao)作(zuo)基(ji)本(ben)相(xiang)同(tong)。由(you)於(yu)核(he)酸(suan)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等(deng)大(da)分(fen)子(zi)物(wu)質(zhi)印(yin)跡(ji)到(dao)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti),容(rong)易(yi)和(he)各(ge)種(zhong)探(tan)針(zhen)發(fa)生(sheng)化(hua)學(xue)或(huo)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying),因(yin)而(er)對(dui)檢(jian)測(ce)樣(yang)品(pin)(尤其是粗樣品)中某些組分的理化性質是有益的。其操作過程所需的試劑量少,靈敏度高,所以應用較為普遍。
印跡法的基本原理
(一)概念
1.探針 用化學方法將有識別能力的物質(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根過氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P),或熒光物質(如異硫氰熒光素、地高辛等)結合成的複合物稱作探針。
2.固相載體 即用於吸附生命大分子物質的固體材料。這類材料有硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜,尼龍膜(nylon-membranes,NDM),重氮苄氧甲基(yloxymethyl,DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether,DPT)紙等。最常用的是孔徑為0.45/lm的NC膜mo,因yin為wei它ta成cheng本ben低di廉lian,結jie合he力li強qiang,背bei景jing較jiao清qing晰xi。而er對dui於yu檢jian測ce核he酸suan和he酸suan性xing蛋dan白bai質zhi來lai說shuo,理li想xiang載zai體ti是shi帶dai正zheng電dian的de尼ni龍long膜mo,它ta與yu負fu電dian荷he物wu質zhi結jie合he力li很hen強qiang,操cao作zuo亦yi簡jian單dan。但dan因yin
為其與負離子型染料也易結合,背景值高,故使用受到一些限製。
3.封阻 用一種與待測物不反應的物質(如蛋白質、核酸、吐溫20等)fengzuzaitiyinjiquyuyiwaideshengyuxifuweidian,shitanzhenyuyinjiwufanying,qiebuxifudaozaitishang,ciguochengchengweifengzu,congershiyinjijieguobeijingganjing,yinjidebandianhuopudaigengweiqingxi。
4.印跡 把經過凝膠電泳後的組分,通過吸附或電泳方法轉移或者以直接點樣方式吸附到固相載體上,此過程稱電泳印跡,或稱點印跡。
5.放射自顯影 將含放射性核素的複合物置X線感光膠片上壓片,當放射性核素電離輻射時,膠片上會發生化學“感光”作用,隨後經顯影,定影,即可呈現出斑點或譜帶,此法較靈敏。
(二)原理
生命大分子物質(如核酸或蛋白質)印跡到固相載體上,經淬滅試劑處理後,可與相應的探針(酶標記)反(fan)應(ying),接(jie)著(zhe)用(yong)適(shi)當(dang)的(de)溶(rong)液(ye)漂(piao)洗(xi),置(zhi)含(han)底(di)物(wu)的(de)溶(rong)液(ye)中(zhong)顯(xian)色(se),即(ji)可(ke)現(xian)出(chu)譜(pu)帶(dai)。如(ru)所(suo)用(yong)探(tan)針(zhen)為(wei)放(fang)射(she)性(xing)核(he)素(su)標(biao)記(ji)物(wu)時(shi),則(ze)應(ying)將(jiang)漂(piao)洗(xi)後(hou)的(de)載(zai)體(ti)進(jin)行(xing)放(fang)射(she)自(zi)顯(xian)影(ying),即(ji)可(ke)檢(jian)測(ce)出(chu)樣(yang)品(pin)中(zhong)特(te)異(yi)的(de)成(cheng)分(fen)。
印跡法的應用
(一)分(fen)析(xi)和(he)製(zhi)備(bei)特(te)異(yi)成(cheng)分(fen)一(yi)般(ban)生(sheng)命(ming)大(da)分(fen)子(zi)如(ru)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等(deng)的(de)粗(cu)製(zhi)品(pin)經(jing)過(guo)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)後(hou),常(chang)常(chang)產(chan)生(sheng)許(xu)多(duo)譜(pu)帶(dai)。但(dan)它(ta)再(zai)經(jing)印(yin)跡(ji)轉(zhuan)移(yi)程(cheng)序(xu)分(fen)析(xi)後(hou),就(jiu)可(ke)以(yi)從(cong)中(zhong)找(zhao)出(chu)所(suo)需(xu)的(de)某(mou)一(yi)特(te)殊(shu)成(cheng)分(fen),而(er)這(zhe)種(zhong)特(te)殊(shu)成(cheng)分(fen)又(you)可(ke)以(yi)從(cong)相(xiang)應(ying)的(de)凝(ning)膠(jiao)區(qu)段(duan)回(hui)收(shou)。用(yong)此(ci)方(fang)法(fa)得(de)到(dao)的(de)物(wu)質(zhi)純(chun)度(du)較(jiao)高(gao),純(chun)化(hua)步(bu)驟(zhou)也(ye)較(jiao)簡(jian)單(dan)。
(二)檢測生命大分子之間的相互作用
不(bu)同(tong)生(sheng)命(ming)大(da)分(fen)子(zi)之(zhi)間(jian)的(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)是(shi)經(jing)常(chang)發(fa)生(sheng)的(de),特(te)別(bie)是(shi)在(zai)有(you)機(ji)體(ti)內(nei)。因(yin)此(ci),建(jian)立(li)一(yi)種(zhong)檢(jian)測(ce)生(sheng)命(ming)大(da)分(fen)子(zi)物(wu)質(zhi)之(zhi)間(jian)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)有(you)效(xiao)方(fang)法(fa)一(yi)直(zhi)是(shi)人(ren)們(men)研(yan)究(jiu)的(de)重(zhong)要(yao)課(ke)題(ti)。而(er)用(yong)印(yin)跡(ji)法(fa)就(jiu)可(ke)以(yi)檢(jian)測(ce)出(chu)如(ru)DNA-RNA、DNA-蛋白質、RNA-蛋白質、酶—底物、糖蛋白—凝集素、激素—受體等物質之間的相互作用,同時也可用此方法尋找各種大分子物質的相應配體
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