雙抗：青黴素100u/ml; 鏈黴素100μl/ml

PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸餾水中加入上述質量物質，用鹽酸調節溶液的pH值至7.4

，加水定容至1L，高壓蒸汽滅菌20分鍾，室溫保存。

 

2.　原代血管內皮細胞的獲取與培養　按Jaffe等人〔1〕defangfajiayigaijin。zaiwujuntiaojianxiaquxinshengerqidai，jianquqianhenheningxuekuaizusaibufen，zhaodaoqijingmai。yiduanchashangdaiyoujiaoguandeboliguanjiezhaguding
，jingjiaoguanjiezhusheqi，yongshengliyanshuiguanxi。daiqijingmaineidecanxuechujinghou
，yong37℃ PBS，衝洗兩次，將另一端用鐵夾夾閉，向臍靜脈內灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml
，夾閉膠管放入已滅菌的大平皿中。37℃孵育12min，zaiciqijianjingchangfandongqidaishimeirongyezaixueguanneiliudongyicushineipixibaojunyunyumeijiechu。quchuqidaihouqingqingjiyaguanbi
，jianghanyouneipixibaodeyidanbaimeizhuru50ml錐形離心管中，加入小牛血清2ml終止酶反應。再以30ml PBS衝洗管腔
，流出液一並入離心管，1000r/min離心10min，棄上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM（Dibco）
？]培養液，充分混合製成細胞懸液。取0.1ml細胞懸液在血細胞計數板計數。最後調細胞數，以1×105/ml接種至24孔培養板中，每孔1ml。置於5%CO2，37℃靜止培養24h更換培養液，以除去未貼壁的細胞。以後每隔2d換液1次，以維持細胞的營養和內環境的穩定。

胰蛋白酶溶液（100ml）配製：1）將D-Hanks（橙紅色）液高壓消毒滅菌，用NaHCO3液調節pH至7.2左右。 2）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許消毒的鹽溶液調成糊狀，然後再補足鹽溶液，攪拌混勻
，置室溫4小時或冰箱內
，並不時攪拌振蕩。 3）次日先用濾紙粗慮，再過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱或－20℃保存備用，常用濃度為0.25％或0.125％

；胰蛋白酶溶液（深紅色）偏酸，使用前用NaHCO3調pH至7.2左右。

D－Hanks液配製：

KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,

Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚紅 0.02 g/L

 

3． 傳代內皮細胞的培養　原代內皮細胞融合後用培養液衝洗兩次，然後用0.25%胰酶加入到內皮細胞中，每孔0.3ml。邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察。細胞皺縮
、彼此分離或呈大片狀分離即可終止消化。加入含有10%小牛血清的培養液，吸管吹打
，製成細胞懸液，計數後按105個細胞/ml，繼續培養。

 

4．血管內皮細胞的鑒定 　1）倒置顯微鏡觀察細胞的形態特點。2）VWF相關抗原免疫熒光檢查：在24孔塑料培養板孔內放置無菌的蓋玻片0.5cm×0.6cm，每孔中種植1ml含有105個細胞的原代或傳代內皮細胞懸液。待內皮細胞生長至近融合狀態時
，取出蓋玻片
，用PBS衝洗3次，投入冷丙酮中（-18～-20℃），細胞麵向上，作用7min

，用PBS衝洗3次
，每次1min，而後進行間接免疫熒光檢查，第一抗體為鼠抗人VWF單克隆抗體

，1∶20倍稀釋，加入50μl於蓋玻片上，放入濕盒內4℃ 。同時不加一抗做陰性對照。用PBS衝洗3次後
，加入異硫氫酸標記的二抗50μl，放入37℃2h後，用PBS洗滌3次。然後立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。 血管內皮細胞鑒定結果：　VWF相(xiang)關(guan)抗(kang)原(yuan)間(jian)接(jie)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)檢(jian)查(zha)

，原(yuan)代(dai)及(ji)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的(de)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)漿(jiang)中(zhong)有(you)黃(huang)綠(lv)色(se)的(de)熒(ying)光(guang)著(zhe)色(se)，胞(bao)核(he)呈(cheng)黑(hei)綠(lv)色(se)，整(zheng)個(ge)細(xi)胞(bao)輪(lun)廓(kuo)清(qing)楚(chu)。作(zuo)為(wei)對(dui)照(zhao)的(de)內(nei)皮(pi)細(xi)胞(bao)片(pian)子(zi)中(zhong)
，偶(ou)見(jian)綠(lv)色(se)斑(ban)點(dian)散(san)發(fa)熒(ying)光(guang)，未(wei)見(jian)細(xi)胞(bao)輪(lun)廓(kuo)。

 

5． 內皮細胞體外生長情況　 用胰蛋白酶消化的人臍靜脈內皮細胞，接種在24孔塑料培養板各孔內4h後
，大部分細胞貼壁。早期細胞呈小多角
、球形、呈團狀，少數細胞伸展，48～72h生長最快
，逐漸生長成梭形，有些細胞排列呈魚貫狀相連，間有旋禍狀排列。核清晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見
，1～2核仁，胞漿豐富，內含小顆粒。於3～4d後融合
，7～10d胞體呈多角形，相互嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。