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色譜又稱色層法或層析法，是一種物理化學分析方法，它利用不同溶質(樣品)與固定相和流動相之間的作用力(分配、吸附、離子交換等)的差別，當兩相做相對移動時，各溶質在兩相間進行多次平衡，使各溶質達到相互分離。
01柱色譜
為wei向xiang玻bo璃li管guan中zhong填tian入ru固gu定ding相xiang，以yi流liu動dong相xiang溶rong劑ji浸jin潤run後hou在zai上shang方fang倒dao入ru待dai分fen離li的de溶rong液ye，再zai滴di加jia流liu動dong相xiang，因yin為wei待dai分fen離li物wu質zhi對dui固gu定ding相xiang的de吸xi附fu力li不bu同tong，吸xi附fu力li大da的de固gu著zhe不bu動dong或huo移yi動dong緩huan慢man，吸xi附fu力li小xiao的de被bei流liu動dong相xiang溶rong劑ji洗xi下xia來lai隨sui流liu動dong相xiang向xiang下xia流liu動dong，從cong而er實shi現xian分fen離li。
02紙色譜
以yi濾lv紙zhi條tiao為wei固gu定ding相xiang，在zai紙zhi條tiao上shang點dian上shang待dai分fen離li的de混hun合he溶rong液ye的de樣yang點dian，將jiang紙zhi條tiao下xia端duan浸jin入ru流liu動dong相xiang溶rong劑ji中zhong懸xuan掛gua，溶rong劑ji因yin為wei毛mao細xi作zuo用yong沿yan濾lv紙zhi條tiao上shang升sheng，樣yang點dian中zhong的de溶rong質zhi從cong而er被bei分fen離li。
03薄層色譜
是在玻璃板上塗以固定相塗層，然後點樣，下端浸入溶劑，同樣自下而上分離。常用於探索柱色譜實驗條件，溶劑和固定相的選擇等。
常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、澱粉等，常用流動相為水、苯等各種有機溶劑。
影響色譜柱使用壽命的主要因素
流動相因素
1.流動相pH
不同基質的填料具有不同的pH適用範圍。常溫下無定形矽膠在純水中的溶解度約為100mg・L-1，且在pH1～9的範圍內溶解的矽膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對於矽膠基質的填料,其所能承受的流動相pH範圍約為1～8。
鍵合相矽膠填料則由於鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應範圍大大增加，如現在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基矽烷鍵合矽膠)，其pH適用範圍可達2～10。當流動相pH值超出酸性範圍時，鍵合相易發生水解而流失；當流動相pH超出堿性範圍時，會加速矽膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應均是不可逆反應，特別是在溫度較高>40℃）的環境下，會使柱效迅速降低而報廢。
2.流動相變質
dangqianshiyongzuiweiguangfandeshiguijijianhexiangtianliao，dangyishuirongyezuoweiliudongxianghuoliudongxiangzhonghanyouyidingnongdudelinsuanyanhuanchongyeshi，shuirongyezhonghuohuanchongyanrongyezhonghuizishengchuyixiexijunhuomeijun，congerdusaigudingxiangkelijiandekongxi。tebieshiduiyuduoyuanzidongbilihunhedegaoxiaoyexiangsepuyilaishuo,水相或緩衝鹽相獨立存貯，因存放時間較長而容易發生此類問題。
3.流動相純度
目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑範圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。
4.其它因素
如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質會破壞矽膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質會破壞化學鍵合矽膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。
樣品因素
1.樣品的溶解性
樣品試樣在配製中，如有少量微粒未能完全溶解，則會隨試樣一起進入色譜柱，同樣，會沉積在柱頭處，造成色譜柱的堵塞。
2.樣品的純度
樣(yang)品(pin)中(zhong)可(ke)能(neng)含(han)有(you)待(dai)分(fen)析(xi)組(zu)分(fen)以(yi)外(wai)的(de)各(ge)種(zhong)組(zu)分(fen)或(huo)雜(za)質(zhi)，這(zhe)些(xie)組(zu)分(fen)或(huo)雜(za)質(zhi)可(ke)能(neng)會(hui)在(zai)柱(zhu)內(nei)產(chan)生(sheng)不(bu)可(ke)逆(ni)吸(xi)附(fu)，從(cong)而(er)，使(shi)固(gu)定(ding)相(xiang)的(de)活(huo)性(xing)點(dian)被(bei)覆(fu)蓋(gai)，保(bao)留(liu)特(te)性(xing)發(fa)生(sheng)變(bian)化(hua)。
3.樣品的化學性質
待(dai)測(ce)試(shi)樣(yang)中(zhong)的(de)各(ge)種(zhong)組(zu)分(fen)與(yu)填(tian)料(liao)之(zhi)間(jian)應(ying)具(ju)有(you)化(hua)學(xue)穩(wen)定(ding)性(xing)，比(bi)較(jiao)典(dian)型(xing)的(de)是(shi)在(zai)使(shi)用(yong)氨(an)基(ji)鍵(jian)合(he)柱(zhu)時(shi)，應(ying)避(bi)免(mian)使(shi)用(yong)含(han)羰(tang)基(ji)的(de)化(hua)合(he)物(wu)和(he)流(liu)動(dong)相(xiang)，如(ru)，丙(bing)酮(tong)、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮發發希夫(Schiff)縮合而使固定相破壞。
其它因素
yingxiangsepuzhushoumingdeyinsuhenduo，chuliudongxiangheyangpinyinsuwai，haiyouqitayixiewaizaiyinsu，ruzhuyadeyingxiang，wendudeyingxiang，sepuzhudezhengquechongxi，sepuzhudezhengqueanzhuangdeng。
色譜柱出現問題的解決辦法
色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬於正常現象。但柱壓在使用過程中突然升高（係統管路堵塞及壓力傳感器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：
1.色譜柱頭的過濾篩板堵塞或汙染。
解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被汙染，可以將色譜柱反方向用甲醇衝洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內超聲清洗10分鍾，後再用純水超聲10分鍾，重新裝入色譜柱。
2.色譜柱頭的填料被樣品汙染。
解決方法：ruquedingsepuzhutoudetianliaobeiwuran，jiangzhutouluosixiexia，wachuzhuneiqianduanbeiwurandetianliao，yongxiangtongdezhutianliaozhongxintianru，zaixixiufuhou，zhongxinanzhuangshangzhutouluosi。
3.色譜柱內緩衝液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出。
解決方法：如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水衝洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。
4.流動相pH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。
解決方法：如果因pH值使用不當，很難恢複。
色譜柱的八大注意事項
1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會衝動柱內填料，因此，在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
2.應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。
3.一般說來色譜柱不能反衝，隻有生產者指明該柱可以反衝時，才可以反衝除去留在柱頭的雜質。否則反衝會迅速降低柱效。
4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以(yi)避(bi)免(mian)固(gu)定(ding)相(xiang)被(bei)破(po)壞(huai)。有(you)時(shi)可(ke)以(yi)在(zai)進(jin)樣(yang)器(qi)前(qian)麵(mian)連(lian)接(jie)一(yi)預(yu)柱(zhu)，分(fen)析(xi)柱(zhu)是(shi)鍵(jian)合(he)矽(gui)膠(jiao)時(shi)，預(yu)柱(zhu)為(wei)矽(gui)膠(jiao)，可(ke)使(shi)流(liu)動(dong)相(xiang)在(zai)進(jin)入(ru)分(fen)析(xi)柱(zhu)之(zhi)前(qian)預(yu)先(xian)被(bei)矽(gui)膠(jiao)“飽和”，避免分析柱中的矽膠基質被溶解。
5.jingchangyongqiangrongjichongxisepuzhu，qingchubaoliuzaizhuneidezazhi。zaijinxingqingxishi，duiliuluxitongzhongliudongxiangdezhihuanyingyixianghunrongderongjizhujianguodu，meizhongliudongxiangdetijiyingshizhutijide20倍左右。
6.保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發幹燥。絕對禁止將緩衝溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被汙染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。在後兩種情況發生時，小心擰開柱接頭，用潔淨小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被汙染填料取淨)再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理後柱效能得到改善，但是很難恢複到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護、延長柱壽命的作用。采用保護柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以矽膠為基質的填料，隻能在pH=2～9範圍內使用。柱子使用一段時間後，可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂，特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。
8.新(xin)的(de)色(se)譜(pu)柱(zhu)在(zai)使(shi)用(yong)一(yi)段(duan)時(shi)間(jian)後(hou)柱(zhu)頂(ding)填(tian)料(liao)可(ke)能(neng)塌(ta)陷(xian)，使(shi)柱(zhu)效(xiao)下(xia)降(jiang)，這(zhe)時(shi)也(ye)可(ke)補(bu)加(jia)填(tian)料(liao)使(shi)柱(zhu)效(xiao)恢(hui)複(fu)。每(mei)次(ci)工(gong)作(zuo)完(wan)後(hou)，最(zui)好(hao)用(yong)洗(xi)脫(tuo)能(neng)力(li)強(qiang)的(de)洗(xi)脫(tuo)液(ye)衝(chong)洗(xi)，例(li)如(ru)，ODS柱宜用甲醇衝洗至基線平衡。當采用鹽緩衝溶液作流動相時，使用完後應用無鹽流動相衝洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不鏽鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4～5天開機衝洗15分鍾。
色譜柱不使用時應該怎樣保存？
如果色譜柱不使用，又該如何進行保存呢？下列方法可供參考：
zaizhuerduanbaoqilai，fangdaohezilishiwenbiguangbaocun。maoxiguanzhukeyiyongfeijiudegediancaichengerkuai，fenbiechazaimaoxiguanerduan。tianchongzhuyongxiaosuliaodaitaozhu，zaiyongxijinshusizhaqilai。yinweifenxishiyouxuduohuaxueshiji，tebiezaichuneihuiyouxieqiwei，zheyangnengjiaohaobaoguansepuzhu。fangzhishiyeyaoyouxufangzhi，maoxiguanzhuhaishiyonghezizhuanghaoyimianyahuai，zaifangzhishizaizhushanghejilubenshangdouzuohaojilu。
拆(chai)下(xia)後(hou)，兩(liang)頭(tou)用(yong)橡(xiang)膠(jiao)墊(dian)密(mi)封(feng)，橡(xiang)膠(jiao)墊(dian)原(yuan)本(ben)色(se)譜(pu)盒(he)子(zi)就(jiu)帶(dai)有(you)，如(ru)果(guo)沒(mei)有(you)，用(yong)進(jin)樣(yang)墊(dian)製(zhi)作(zuo)一(yi)下(xia)就(jiu)可(ke)以(yi)了(le)，然(ran)後(hou)裝(zhuang)在(zai)原(yuan)來(lai)的(de)色(se)譜(pu)盒(he)子(zi)裏(li)麵(mian)，備(bei)注(zhu)上(shang)相(xiang)應(ying)的(de)信(xin)息(xi)。通(tong)常(chang)要(yao)求(qiu)放(fang)在(zai)幹(gan)燥(zao)的(de)地(di)方(fang)，下(xia)次(ci)使(shi)用(yong)時(shi)，切(qie)記(ji)進(jin)樣(yang)端(duan)和(he)出(chu)口(kou)端(duan)不(bu)能(neng)裝(zhuang)反(fan)。
高效液相色譜柱的正確使用
1.加裝保護柱
保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現在的色譜儀在流動相吸入口、進樣閥後部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器隻能除去不溶性顆粒而不能除去化學汙然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等複雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱必不可少的措施。
保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品,經過一定次數的樣品分析(50～100次)後,出現柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應考慮更換保護柱。
2.過濾流動相和樣品
流動相通常由水或緩衝溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經過色譜柱的流動相均應過濾,但在實際操作上應視具體情況而有所區別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機溶劑的質量且沒有受到汙染時,過濾並無更多實際意義。
當流動相中含有緩衝鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當緩衝溶液放置一段時間(視環境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)後,在使用前還應重新過濾。
所配製的樣品試液在注入流路係統前均要經0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區分水係和油係,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成汙染。裝流動相的容器和色譜係統中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。
3.淨化樣品
當樣品中含有對色譜柱有損害的化學成分,如產生永久性吸附的蛋白質、糖等有機分子和強吸附性物質,以及可能對柱填料產生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多餘雜質組分。
4.避免過高的柱壓
雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是：
(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。
(2)當流速較大時,應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。
(3)使用手動進樣閥時,進樣閥的切換要盡可能的快。否則
超過20%的壓力衝擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯用時,柱切換要避免在高壓下進行。
5.注意溫度和酸堿度
一般以矽膠為基質的色譜柱最高使用溫度不超過60℃，以低於40℃為宜，特別是在流動相pH接(jie)近(jin)使(shi)用(yong)限(xian)度(du)時(shi)，更(geng)應(ying)降(jiang)低(di)使(shi)用(yong)溫(wen)度(du)。溫(wen)度(du)過(guo)高(gao)會(hui)加(jia)快(kuai)鍵(jian)合(he)相(xiang)的(de)水(shui)解(jie)和(he)矽(gui)膠(jiao)的(de)溶(rong)解(jie)，從(cong)而(er)，使(shi)填(tian)料(liao)性(xing)質(zhi)改(gai)變(bian)，柱(zhu)床(chuang)塌(ta)陷(xian)，降(jiang)低(di)柱(zhu)效(xiao)，改(gai)變(bian)峰(feng)形(xing)。目(mu)前(qian)的(de)鍵(jian)合(he)矽(gui)膠(jiao)色(se)譜(pu)柱(zhu)標(biao)示(shi)的(de)pH適用範圍可達2～10,但在實際使用時應避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害：
（1）在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相；
（2）降低使用溫度；
（3）檢驗完畢後立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗；
6.正確及時的衝洗
開始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對於新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是唯一能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。
反相鍵合矽膠柱適宜的保存環境是純甲醇,如分析用流動相為緩衝液有機溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇水置換掉原來的純甲醇,再進分析用流動相，以防止在柱內發生鹽的沉澱；試驗結束後,要及時用適當的溶劑衝洗係統並最終過渡到純甲醇衝洗,對於含有緩衝鹽的流動相，最好的辦法是先用與分析用流動相組成完全相同但不含緩衝鹽的溶液進行衝洗，再逐步過渡到純甲醇衝洗。
多數衝洗液體積大約為柱容積的15～20倍,但最終要以基線是否平直、壓力是否穩定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的最低使用濃度為≥5%,使用時應給予注意。
文章來源：老木魚
