手機版
空白對照平板上又生長菌落，到底怎麼溯源？
一、方法原理：
采用頭腦風暴法（拍腦袋想，紙上談兵）heluojixuefangfajinxingjiandantuilipanduan。yibianzhaowuranyuan，yibianzaizhaodeguochengzhongxiaochudiaoyixiewuranyuan。zaishunxupaichuwuranyuanshi，keyiweixiayibuzuopudian，xiaochudiaoyixiebanjiaodekenengxing，congerpaichuqilaigengshunchang。zhazhaoqitabuzhoujianlilianghaojichuyeshiweilezuizhongmudefuwu，zuizhongmudejiushixiaochusuoyouqianzaiwuranyuan。zhelihenfoxidejiang，zhaodaohuomeizhaodaowuranyuantoudoukeyi，bubitaijiujie。
二、建立假設（越詳細越好），還原“案發現場”。
假設按照GB 4789.2-2022進行菌落總數計數，操作過程如下：
（一）、稱樣、均質，製備濃度0.1g/mL的樣品勻液B。
超淨台通風，開著照明燈。點燃酒精燈，在火焰周圍稱樣：稱取樣品A25.0g，入到1L的均質袋裏，同時把滅菌好的225mL磷酸鹽緩衝溶液，也加入到1L的均質袋裏，總體積250mL，封口，計為樣品勻液B。
均質袋拿出超淨台，放入桌麵上的均質器內，開啟均質器拍打均質袋1min。取出均質袋，放入超淨台內，放在均質袋支架上。
（二）、10倍梯度稀釋法稀釋樣品和製備空白對照。
超淨台通著風，酒精燈燃著，在火焰周圍開啟均質袋口，用1mL移液器裝上吸頭盒裏麵的1mL規格的移液器吸頭，開始10倍梯度稀釋。
吸取1mL樣品勻液B（0.1g/mL），加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩衝溶液），得到樣品勻液C（0.01g/mL）。
同理：吸取1mL樣品勻液C，加入預先滅菌過的18mm×150mm試管中（裝有滅過菌的9mL磷酸鹽緩衝溶液），得到樣品勻液D（0.001g/mL）。
...此為10倍梯度稀釋法原理，如果要稀釋n個10倍管（n≥3），按照同理往下即可。暫時認為樣品勻液B、C、D濃度就夠用了。
（三）、傾注平板法製樣品皿和空白對照皿。
預先準備8個滅過菌的空培養皿、1瓶200mL左右的熔化的PCA培養基保溫在水浴48℃中。混勻樣品勻液B、C、D。
分別取1mL樣品勻液B，加入到空白皿1、2，
分別取1mL樣品勻液C，加入到空白皿3、4，
分別取1mL樣品勻液D，加入到空白皿5、6，
分別取1mL磷酸鹽緩衝溶液，加入到空白皿7、8。
傾注PCA培養基至1~8皿，每皿20mL，冷卻、凝固。這樣，裝有樣品的皿分別是皿1、2、3、4、5、6，裏麵的濃度分別為0.1g/mL,0.01g/mL,0.001g/mL；皿7、8為空白對照皿。
（四）、培養、計數。
將皿1~8，倒置放入培養箱中，36℃培養48h。菌落計數。
（五）、發現空白對照皿中有菌落汙染。
假設發現：1、很多菌，比如幾十個以上。
假設發現：2、皿7菌落數0，皿8菌落數1。意思菌很少。
三、空白汙染來源可能性的理論分析：
（一）、要進行溯源性調查，要了解幾個概念和相互關係。
1.概念：充分條件，必要條件，充要條件。
2.相互關係：
假設A是條件，B是結論，設C、D分別為A、B所描述對象的集合，則有下列定義和推論：
（1）由A可以推出B，由B可以推出A，則A是B的充分必要條件（此時C等於D）；
（2）由A可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的充分不必要條件（此時C包含於D，且不相等）；
（3）由A不可以推出B，由B可以推出A，則A是B的必要不充分條件（此時D包含於C，且不相等）；
（4）由A不可以推出B，由B不可以推出A，則A是B的既不充分也不必要條件（此時C不包含D，D也不包含C）。
（二）、如果（一）中充分條件，必要條件，充要條件相互關係太抽象，想不明白的話，可以參考具體事例進行理解。
例如：空白對照皿中汙染（以後簡稱：空白汙染）和汙染來源之間的關係。
判斷1：假如滅菌鍋滅菌不徹底，那麼空白肯定汙染（理論上）。
判斷2：假如移液器引入雜菌，那麼空白肯定汙染（理論上）。
理解1：觀察判斷1和判斷2，我們發現，隻要[滅菌鍋和（/或）移液器]引入汙染，都會導致最終空白汙染，所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白汙染的充分條件之一。
理解2：空白汙染，不能推出滅菌鍋滅菌不徹底。
因為假設滅菌鍋滅菌徹底，其他環節汙染，也能導致最終空白長菌。所以（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白汙染的非必要條件。
理解3：綜合理解1和理解2，（1）滅菌鍋滅菌不徹底是空白汙染的充分非必要條件。
（三）、弄清楚空白汙染（結果）和各個環境引入雜菌（汙染的可能性，條件）之間的關係，我們就可以進行推斷，也就是溯源性調查。
還有一些隱藏的條件如：空白對照皿中汙染的菌不是憑空產生的（因為微生物不會憑空出現），它(ta)隻(zhi)會(hui)從(cong)我(wo)們(men)做(zuo)實(shi)驗(yan)的(de)操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)的(de)某(mou)一(yi)個(ge)或(huo)多(duo)個(ge)甚(shen)至(zhi)極(ji)端(duan)到(dao)全(quan)部(bu)環(huan)節(jie)引(yin)入(ru)。又(you)因(yin)為(wei)空(kong)白(bai)汙(wu)染(ran)的(de)來(lai)源(yuan)很(hen)多(duo)，某(mou)一(yi)個(ge)汙(wu)染(ran)都(dou)隻(zhi)是(shi)空(kong)白(bai)汙(wu)染(ran)的(de)充(chong)分(fen)非(fei)必(bi)要(yao)條(tiao)件(jian)（一個源引入汙染或多個源引入汙染，都會導致最終現象-空白汙染）。
womenzhiyaobasuoyoudewuranlaiyuandouzhadaozhuadaoyiqi，basuoyoudewuranlaiyuankanchengyigezhengti，namezhegezhengtihekongbaiwuranjiugouchenglechongfenbiyaotiaojian。zheqizhongcunzaimeiyouyinruwurande，yezangzhe1個或多個汙染來源。我們的目的就是抓到（如果可能）並消除汙染來源，使以後不再發生。
（四）、（三）中提到“我們的目的就是抓到（如果可能）並消除汙染來源，使以後不再發生。”這裏對如果可能進行解釋。
我們溯源調查采用的是通過假設、重複實驗驗證這樣的一個方法，這是有別於真實發生了汙染的那次實驗，時間和條件都有變化，是一種情景還原模擬。
重複試驗有時候能重複出來，比如設備某一個地方汙染，再去檢測還能檢測到菌。
重(zhong)複(fu)試(shi)驗(yan)有(you)時(shi)候(hou)不(bu)能(neng)重(zhong)複(fu)出(chu)來(lai)，比(bi)如(ru)檢(jian)測(ce)員(yuan)汙(wu)染(ran)那(na)次(ci)手(shou)上(shang)帶(dai)了(le)菌(jun)，情(qing)景(jing)再(zai)現(xian)時(shi)，消(xiao)毒(du)和(he)操(cao)作(zuo)都(dou)嚴(yan)格(ge)了(le)，重(zhong)複(fu)不(bu)出(chu)來(lai)了(le)。所(suo)以(yi)針(zhen)對(dui)這(zhe)一(yi)現(xian)象(xiang)我(wo)們(men)要(yao)提(ti)醒(xing)做(zuo)重(zhong)複(fu)實(shi)驗(yan)的(de)人(ren)員(yuan)，讓(rang)他(ta)盡(jin)量(liang)還(hai)原(yuan)上(shang)一(yi)次(ci)的(de)情(qing)況(kuang)，不(bu)必(bi)太(tai)認(ren)真(zhen)也(ye)不(bu)必(bi)太(tai)放(fang)鬆(song)，越(yue)接(jie)近(jin)上(shang)一(yi)次(ci)的(de)情(qing)況(kuang)模(mo)擬(ni)效(xiao)果(guo)越(yue)好(hao)。
重zhong複fu試shi驗yan的de可ke能neng出chu現xian和he可ke能neng不bu出chu現xian的de不bu確que定ding性xing，讓rang我wo們men要yao我wo們men適shi當dang進jin行xing變bian通tong，由you原yuan來lai找zhao到dao汙wu染ran來lai源yuan並bing消xiao除chu，改gai成cheng努nu力li尋xun找zhao汙wu染ran來lai源yuan，如ru果guo抓zhua不bu到dao，退tui而er求qiu其qi次ci，隻zhi要yao能neng消xiao除chu汙wu染ran來lai源yuan，通tong過guo後hou續xu驗yan證zheng，發fa現xian這zhe一yi現xian象xiang不bu在zai出chu現xian，也ye可ke以yi認ren為wei達da到dao了le溯su源yuan調tiao查zha的de目mu的de。
這個地方一定要想通，否則可能造成一種高尚的自虐行為。這一點要特別提醒檢測員，是因為我們特殊的職業習慣（趨近完麵和強迫症），檢測人員越嚴謹認真，有時候容易鑽牛角尖，找不到汙染來源時，可能被嚴謹和認真“反噬”，走火入魔，吃不好睡不好，整個人都不好了。
四、頭腦風暴法列出可能的汙染來源：
回看 “二、假設條件（越詳細越好）”寫各種設備及操作過程較為詳細，這一點在溯源性調查中非常重要。我們要建立機製尋找較為全麵的汙染來源。
作(zuo)為(wei)微(wei)生(sheng)物(wu)單(dan)一(yi)菌(jun)體(ti)肉(rou)眼(yan)不(bu)可(ke)見(jian)的(de)特(te)點(dian)，汙(wu)染(ran)的(de)來(lai)源(yuan)藏(zang)在(zai)每(mei)一(yi)個(ge)細(xi)節(jie)裏(li)，所(suo)以(yi)進(jin)行(xing)頭(tou)腦(nao)風(feng)暴(bao)時(shi)，一(yi)定(ding)要(yao)觀(guan)察(cha)入(ru)微(wei)，調(tiao)查(zha)仔(zai)細(xi)，不(bu)放(fang)過(guo)任(ren)何(he)的(de)可(ke)能(neng)性(xing)，簡(jian)單(dan)的(de)思(si)想(xiang)就(jiu)是(shi)：懷疑一切。
如果想象力不很強大的人，平時可以多練習冥想，提高自己想象力。也可以通過回憶檢測過程、紙上談兵模擬推演檢測過程來幫助我們還原一個近似真實的“案發現場”。
簡單風暴如下（因為每個人的操作習慣及每一次偶然事件形成的特殊性，每個人要根據自己的情況進行仔細進行）：我們按檢測過程進行規律性的瞎猜。
1.滅菌鍋：
1.1、滅菌不徹底，滅完還有菌活的；
1.2、其他一切詭異的隻有想不到沒有做不到的奇跡一般的汙染可能性的客觀存在。
2.超淨台：
2.1超淨台過濾效力下降，風中帶菌。
2.2其他一切詭異的隻有想不到沒有做不到的奇跡一般的汙染可能性的客觀存在。
3.超淨台內部操作不當：
3.1沒開風。
3.2風力太小，亂流。
3.3超淨台沒擦拭，環境惡劣。
3.4操作過程中離酒精燈遠。
3.5操作過程移液器帶菌汙染。
3.6操作過程中拿進拿出樣品汙染影響了環境造成汙染。
3.7人帶進去菌汙染。
3.8其他一切詭異的隻有想不到沒有做不到的奇跡一般的汙染可能性的客觀存在。
4.培養箱內造成的汙染。
4.1風太大，吹進去。
4.2皿太濕，菌爬進去。
4.3培養箱環境惡劣，隻要進去就有菌汙染的小概率奇跡事件存在。
4.4其他一切詭異的隻有想不到沒有做不到的奇跡一般的汙染可能性的客觀存在。
5.其他：
5.1槍頭不新鮮。
5.2槍頭盒不新鮮。
5.3皿滅完濕漉漉的沒吹幹，菌爬進去了。
5.4其他一切詭異的隻有想不到沒有做不到的奇跡一般的汙染可能性的客觀存在
五、汙染源調查要充分考慮順序性：
做事有序，處理事情就顯得簡單，大腦處理起來也愉悅，同樣溯源性調查時，充分利用分類學，真相會相對容易發現。
所suo以yi枚mei舉ju時shi，要yao充chong分fen考kao慮lv順shun序xu性xing。盡jin可ke能neng分fen塊kuai進jin行xing頭tou腦nao風feng暴bao，一yi方fang麵mian不bu容rong易yi漏lou掉diao，一yi方fang麵mian也ye有you利li於yu我wo們men回hui頭tou檢jian查zha自zi己ji是shi否fou漏lou掉diao了le一yi些xie細xi節jie性xing的de部bu分fen，化hua整zheng為wei零ling，逐zhu一yi擊ji破po。相xiang反fan，雜za亂luan無wu章zhang的de亂luan想xiang是shi不bu科ke學xue的de，擾rao亂luan了le自zi己ji的de心xin緒xu，也ye容rong易yi漏lou掉diao一yi些xie可ke能neng性xing。
另外，順序條理的想問題，就把隨機性變成了一種特殊性，更好找規律。這在消除時也有幫助。
六、提出消除汙染來源的試驗方案：
經過充分、有序的找到汙染來源後。我們可以按從流程的源頭往後重新重複試驗和排查。采用排除法。
我們做微生物實驗最重要的概念之一“無菌概念”。也許無菌概念太抽象，那麼我們反過來，提出“有菌概念”。意思整個環境都是有菌的，這就是有菌概念。那麼要想獲取無菌的環境，隻有在有菌的環境中撕開一個口子，製造無菌環境。
（一）首先，起點定在滅菌鍋這裏（如果煮沸的培養基就不是這裏了，沒說盡的事情自己靈活掌握），滅菌鍋是“潔淨之源”，重複滅菌看滅菌鍋滅菌充分不充分，由於滅菌後驗證單獨不好執行。就考慮和培養箱、培養基聯係在一起進行捆綁驗證。意思就是沒有汙染就都算合格，有汙染再分別調查看是哪個汙染。
同時重複實驗時考慮培養皿、培養基、移液器吸頭等是否有引入汙染的可能性，都通過重複實驗和簡單對比進行。
具體操作：準備100mL的三角瓶，每瓶配30mL的固體培養基，如此配10瓶，放在滅菌鍋的不同位置和層之間，按照之前的滅菌方式滅菌（不要過嚴也不要放鬆，目的是盡可能的還原汙染時候滅菌的情況）進行滅菌，滅菌後凝固了直接放培養箱裏麵36℃培養48h。
（二）滅菌鍋滅菌不徹底和培養箱的汙染可能性的排查。
培養後觀察結果，再沒有看到皿時，會有2種可能：沒長菌和長菌。
1.沒長菌。
認為培養箱、滅菌鍋是沒有汙染的，繼續下一步調查。如果對一次試驗不放心，可以重複此實驗3~5次，都沒有問題則認為這步驟無汙染。
2長菌。
認為滅菌鍋、培養箱之間至少一個環節造成汙染，為了區別是滅菌不充分還是培養過程進去的，滅完菌後讓三角瓶適當幹燥後，直接室溫放置（培養）48h，從而可以區分。另外需要注意的是，如果瓶子培養基菌很多，表麵、內部都有，那麼可以認為是滅菌不徹底，因為一方麵環境空氣中要進入三角瓶不容易（有封口膜封口），就jiu算suan進jin入ru數shu量liang也ye少shao，要yao進jin入ru培pei養yang基ji內nei部bu可ke能neng性xing幾ji乎hu不bu可ke能neng，所suo以yi這zhe時shi候hou重zhong點dian就jiu放fang在zai驗yan證zheng滅mie菌jun鍋guo滅mie菌jun效xiao果guo上shang，比bi如ru使shi用yong生sheng物wu指zhi示shi劑ji驗yan證zheng。
（三）滅菌鍋已確認汙染來源情況並進行了消除後，開展超淨台內汙染可能性的排查。
針對“2.1超淨台過濾效力下降，風中帶菌”，做(zuo)沉(chen)降(jiang)菌(jun)試(shi)驗(yan)，看(kan)看(kan)吹(chui)出(chu)來(lai)的(de)風(feng)是(shi)不(bu)是(shi)有(you)汙(wu)染(ran)。這(zhe)時(shi)候(hou)順(shun)序(xu)排(pai)查(zha)的(de)優(you)勢(shi)就(jiu)出(chu)來(lai)了(le)，隻(zhi)有(you)鍋(guo)好(hao)的(de)，培(pei)養(yang)基(ji)滅(mie)完(wan)是(shi)無(wu)菌(jun)的(de)，沉(chen)降(jiang)菌(jun)出(chu)現(xian)菌(jun)才(cai)能(neng)說(shuo)明(ming)排(pai)風(feng)有(you)問(wen)題(ti)，當(dang)然(ran)同(tong)時(shi)要(yao)注(zhu)意(yi)排(pai)除(chu)人(ren)的(de)汙(wu)染(ran)性(xing)。
zuochenjiangzhiqian，chaojingtaikeyijinxingyicicashiheqingjie，zheyangruguomeiyouwuranleyehao，yinweiwomenzhaodaohuozhaobudaowuranyuandoubuyaojin，zhongyaodeshiyihoubuzaichuxianzhegewurandexianxiang。
針對“超淨台內部操作不當”deyuanyin，yaokaolvrenweiyuanyin，yaojianliwujungainian，yijikeyijigerenyiqicaozuohuojinxingwaibupeixundeng，xiaochugerencaozuodeyixielouxi。congerdadaofanfushiyanyebuwuran，cainengshanggang，zongzhiweishengwujichuhaixuyaojiaqiang。
超淨台沒問題了，就去考慮培養箱的問題。
七、總結一下汙染物溯源調查的思路：
汙(wu)染(ran)物(wu)溯(su)源(yuan)調(tiao)查(zha)沒(mei)有(you)定(ding)法(fa)，腦(nao)子(zi)要(yao)活(huo)絡(luo)，一(yi)方(fang)麵(mian)要(yao)非(fei)常(chang)熟(shu)悉(xi)檢(jian)測(ce)流(liu)程(cheng)和(he)建(jian)立(li)關(guan)鍵(jian)控(kong)製(zhi)點(dian)，同(tong)時(shi)要(yao)充(chong)分(fen)考(kao)慮(lv)被(bei)汙(wu)染(ran)的(de)每(mei)一(yi)個(ge)環(huan)節(jie)，前(qian)後(hou)推(tui)敲(qiao)，找(zhao)出(chu)盡(jin)可(ke)能(neng)多(duo)的(de)汙(wu)染(ran)來(lai)源(yuan)。在(zai)設(she)想(xiang)汙(wu)染(ran)可(ke)能(neng)性(xing)的(de)起(qi)始(shi)階(jie)段(duan)，要(yao)放(fang)下(xia)“我沒有做錯，我沒汙染”的(de)思(si)想(xiang)包(bao)袱(fu)，要(yao)懷(huai)疑(yi)一(yi)切(qie)，假(jia)設(she)每(mei)個(ge)細(xi)節(jie)都(dou)有(you)汙(wu)染(ran)，我(wo)們(men)通(tong)過(guo)試(shi)驗(yan)去(qu)證(zheng)明(ming)是(shi)否(fou)有(you)汙(wu)染(ran)，因(yin)為(wei)實(shi)踐(jian)是(shi)檢(jian)驗(yan)真(zhen)理(li)的(de)唯(wei)一(yi)標(biao)準(zhun)，真(zhen)理(li)沒(mei)有(you)經(jing)過(guo)實(shi)踐(jian)驗(yan)證(zheng)，都(dou)可(ke)能(neng)是(shi)謬(miu)誤(wu)。這(zhe)是(shi)建(jian)立(li)在(zai)我(wo)們(men)唯(wei)物(wu)主(zhu)義(yi)價(jia)值(zhi)觀(guan)以(yi)及(ji)認(ren)為(wei)世(shi)界(jie)是(shi)客(ke)觀(guan)存(cun)在(zai)、以及客觀存在是正確的統一認識基礎上的（這個認識從牛頓時代才建立的）。
理出一個排除的思路，盡量按照順序、分塊、化整為零的方式進行，充分考慮各種可能性之間的如關聯、排他等內在邏輯關係。排除過程中嚴謹推斷，不能遺漏。
同時還要考慮主觀能動性，有些地方單一搞不了，那就分分合合，怎麼方便怎麼能達到最終消除汙染就行。
這樣一步一步走下去，最終找到真相，從而消除空白汙染。
