dangjianliyaopindeweishengwuxiandujianzhashi
，yingjinxingkongzhijunjianzhafangfadeyanzheng，yiquerensuocaiyongdefangfashiheyugaiyaopindedekongzhijunjianzhafangfaceding。ruoyaopindezufenhuoyuanjianyantiaojianfashenggaibiankenengyingxiangjianyanjieguoshi，jianyanfangfayingjinxingzhongxinyanzheng。yanzhengshiyanyekeyugongshipindekongzhijunjianzhatongshijinxing。

1.3.1.驗證用菌株 

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

驗證實驗所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍幹燥菌種為0 代），並采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。  

1.3.2.菌液製備 

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌
、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至10ml營養肉湯培養基中，35～37℃培養18～24小時
；分別取培養液 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液

，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7
，製成每1ml含菌數10～100cfu的菌懸液。   

1.3.3. 陰性菌對照組

設立陰性菌對照組是為了驗證該控製菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌
、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌

、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。  

1.3.4.試驗組

1.3.4.1.常規法

◆ 大腸埃希菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu
，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu
，35～37℃培養18～24小時，取此培養物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項下規定檢查。

◆大腸菌群 取含適量（不少於10ml）的膽鹽乳糖發酵培養基管3支
，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu
，35～37℃培養18～24小時
，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項下規定檢查。

◆沙門氏菌 取供試品10g或10ml，直接或處理後接種至適量（不少於200ml）的營養肉湯培養基中

，用勻漿儀或其他適宜方法混勻
，陽性菌對照加入沙門菌 10～100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu
，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。

◆銅綠假單胞菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》沙門菌項下規定檢查。 

◆ 金黃色葡萄球菌 取相當於1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu
，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10～100cfu
，35～37℃培養18～24小時。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項下規定檢查。

1.3.4.2. 培養基稀釋法 供試品有抑菌作用
，放大培養基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由於容器體積限製，一般放大到500ml或1000ml，本法適用於抑菌作用不強的樣品。

1.3.4.3. 薄膜過濾法 采cai用yong薄bo膜mo過guo濾lv法fa時shi，取qu規gui定ding量liang供gong試shi液ye
，過guo濾lv，衝chong洗xi，試shi驗yan菌jun應ying加jia在zai最zui後hou一yi次ci衝chong洗xi液ye中zhong，過guo濾lv後hou，注zhu入ru培pei養yang基ji或huo取qu出chu濾lv膜mo接jie入ru增zeng菌jun培pei養yang基ji中zhong。 

1.3.4.4. 離心沉澱集菌法 取規定量供試液
，如供試液含許多藥渣，先以500轉/分鍾離心3~5分鍾
，取全部上清液
，再以3000轉/分離心20分鍾，取下麵1ml液體
，並將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一並移入同瓶增菌液中
，培養，本法適用於中度抑菌作用的樣品。 

1.3.4.5.中和法 zaigongshipinrongyezhongjiaruxiangyingdezhongheji，yijianchugongshipinzhongyijunchengfendezuoyong
，zhonghejiyingduiweishengwuwuduxing
，yuyijunchengfenjiehehoudechanwuyingduiweishengwuyiwuduxing，huoyouduxingdanbuyingxiangdaijianjundejianchu。  

1.3.5.結果判斷 

至少應進行3次ci獨du立li平ping行xing試shi驗yan。陰yin性xing菌jun對dui照zhao組zu不bu得de檢jian出chu陰yin性xing對dui照zhao菌jun。若ruo試shi驗yan組zu檢jian出chu試shi驗yan菌jun，照zhao該gai供gong試shi液ye製zhi備bei方fang法fa和he控kong製zhi菌jun檢jian查zha法fa進jin行xing該gai供gong試shi品pin控kong製zhi菌jun的de檢jian查zha
；若試驗組未檢出試驗菌
，應采用自然沉降法、培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，並重新進行方法驗證。 

2.驗證的實施 

2.1細菌、黴菌及酵母菌計數方法驗證記錄及控製菌檢驗方法驗證記錄(見附件)。

2.2.分析數據，綜合整個驗證過程，得出驗證結論。 

2.3.驗證過程中發生的異常情況
，按照《偏差處理程序》進行處理。 

3.相關文件

《微生物限度檢查SOP》

4.再驗證

4.1.藥品的組分發生改變可能影響檢驗結果時。 

4.2.驗證時檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時。