答：可以從這幾個方麵一一考慮：

 

（1）shejidekangyuanyubeimianyidedongwuneiyuandanbaiyoujigaodetongyuanxinghuozhekangyuanshimianyiyuanxingjichadexiaofenziwuzhi。duiyuqianyizhongqingkuangyinggaizhongxinshejikangyuan，shejikangyuanshijinliangxuanqumubiaodanbaiteyixingdexulie
，keyishejiweiduantairanhouzaiyuzaitidanbaioulianzhihoumianyi
；對於後一種情況，首先確認小分子物質是否已經正確地和載體蛋白偶聯，如果偶聯沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優先考慮的蛋白。

 

（2）免(mian)疫(yi)的(de)周(zhou)期(qi)不(bu)正(zheng)確(que)。免(mian)疫(yi)周(zhou)期(qi)過(guo)長(chang)或(huo)過(guo)短(duan)，各(ge)免(mian)疫(yi)步(bu)驟(zhou)之(zhi)間(jian)的(de)間(jian)隔(ge)過(guo)長(chang)或(huo)過(guo)短(duan)都(dou)有(you)可(ke)能(neng)影(ying)響(xiang)免(mian)疫(yi)效(xiao)果(guo)，詳(xiang)細(xi)請(qing)參(can)考(kao)本(ben)站(zhan)有(you)關(guan)動(dong)物(wu)免(mian)疫(yi)的(de)部(bu)份(fen)
，實(shi)際(ji)操(cao)作(zuo)中(zhong)的(de)相(xiang)關(guan)程(cheng)序(xu)與(yu)本(ben)站(zhan)推(tui)薦(jian)的(de)程(cheng)序(xu)相(xiang)差(cha)盡(jin)裏(li)不(bu)超(chao)過(guo)50%的偏差。

 

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時
，對於某些抗原可能效果不佳
，弗低佐劑也不能保證完全有效，此時可以考慮更換佐劑嚐試。

 

（4）免mian疫yi劑ji量liang不bu合he理li。過guo大da的de免mian疫yi劑ji量liang可ke能neng導dao致zhi免mian疫yi耐nai受shou，過guo少shao的de免mian疫yi劑ji量liang可ke能neng無wu法fa激ji活huo免mian疫yi應ying答da。一yi般ban來lai說shuo，實shi際ji免mian疫yi劑ji量liang與yu本ben站zhan所suo推tui薦jian的de劑ji量liang不bu要yao相xiang差cha兩liang倍bei以yi上shang。

 

（5）免疫途徑不合理。對於有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內免疫方法
，具體操作本站上也有詳細的講解。

 

（6）測效價的過程存在錯誤操作
，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時
，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對於小分子物質，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

 

2.  為什麼融合後細胞不長或者融合後克隆很少
？

 

答：可以從這幾個方麵考慮：

 

（1）免疫用的動物品係不正確或者品係不純。免疫用的動物一般應該與骨髓瘤來源的動物是相同品係，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應該選用Balb/C小鼠
，同時必須使用品係純正的小鼠。

 

（2）培養基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低
，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

 

（3）培養基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質血清。

 

（4）未正確製備飼養層細胞。參見本站有關飼養層細胞製備的部份。

 

（5）接種雜交瘤細胞的培養板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

 

（6）融合後，未及時轉移或稀釋細胞。有人在做融合後喜歡把融合的細胞先放在培養瓶中培養，然後再滴到96孔板上。如果在培養瓶中培養的時間過長
，也可能出現克隆利率少的情況。

 

（7）細xi胞bao被bei汙wu染ran。在zai顯xian微wei鏡jing下xia仔zai細xi觀guan察cha是shi否fou有you明ming顯xian的de微wei生sheng物wu汙wu染ran。即ji使shi看kan不bu到dao有you明ming顯xian的de微wei生sheng物wu，也ye應ying該gai考kao慮lv是shi否fou有you支zhi原yuan體ti汙wu染ran，有you條tiao件jian的de可ke以yi做zuo支zhi原yuan體ti檢jian測ce。

 

（8）細胞培養條件不正確，確保細胞培養在恒定的37度較濕的環境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

 

（9）其它與融合條件相關的不恰當的因素。詳見本站有關細胞融合的部份。

 

3.  為什麼融合後得不到陽性克隆？

 

答：可能的原因：

 

（1）動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁麵第1個問題。

 

（2）融合後得到的克隆較少
，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁麵第2個問題。

 

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質不可以直接包被到酶標板上
，再如使用了不適當的二抗等諸多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

 

（4）抗(kang)原(yuan)成(cheng)份(fen)與(yu)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)中(zhong)的(de)物(wu)質(zhi)相(xiang)同(tong)或(huo)類(lei)似(si)，或(huo)者(zhe)與(yu)篩(shai)選(xuan)過(guo)程(cheng)中(zhong)有(you)同(tong)抗(kang)原(yuan)結(jie)構(gou)相(xiang)同(tong)或(huo)類(lei)似(si)的(de)物(wu)質(zhi)產(chan)生(sheng)了(le)競(jing)爭(zheng)反(fan)應(ying)。舉(ju)個(ge)簡(jian)單(dan)的(de)例(li)子(zi)
，如(ru)果(guo)需(xu)要(yao)製(zhi)備(bei)抗(kang)BSA 的單抗
，則養雜交瘤的培養基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結合，最後做ELISA篩(shai)選(xuan)的(de)時(shi)候(hou)無(wu)法(fa)得(de)到(dao)陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)。解(jie)決(jue)的(de)辦(ban)法(fa)隻(zhi)有(you)使(shi)用(yong)其(qi)它(ta)的(de)動(dong)物(wu)的(de)血(xue)清(qing)或(huo)者(zhe)使(shi)用(yong)無(wu)血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)。再(zai)如(ru)，如(ru)果(guo)需(xu)要(yao)製(zhi)備(bei)酪(lao)蛋(dan)白(bai)的(de)單(dan)抗(kang)
，則(ze)做(zuo)ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

 

（5）其它所有能影響ELISA等相關篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關ELISA實驗的講解與討論。

 

4.  為什麼我的細胞生長很慢？

 

答：可能的原因：

 

（1）使用了劣質的培養耗材、培養基、血清
、HAT或HT。建jian議yi新xin手shou使shi用yong知zhi名ming廠chang商shang的de試shi劑ji或huo耗hao材cai。對dui於yu血xue清qing，可ke能neng需xu要yao從cong多duo個ge廠chang家jia選xuan用yong多duo個ge批pi次ci試shi用yong
，選xuan擇ze出chu比bi較jiao好hao的de批pi次ci進jin行xing實shi驗yan。在zai試shi用yong血xue清qing的de時shi候hou

，一yi般ban可ke以yi使shi用yong相xiang對dui較jiao低di濃nong度du的de血xue清qing進jin行xing骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao培pei養yang實shi驗yan，根gen據ju骨gu髓sui瘤liu細xi胞bao的de倍bei增zeng速su度du確que實shi血xue清qing質zhi量liang。

 

（2）使用的血清或培養基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

 

（3）製備飼養層的方法不正確。參見本頁麵第二個問題。

 

（4）其它問題
，可以參考本頁麵第二個問題。

 

5.  我的克隆原來是陽性的，為什麼後來轉為陰性了

？

 

答：首shou先xian要yao注zhu意yi的de是shi
，正zheng常chang情qing況kuang下xia
，雜za交jiao瘤liu也ye不bu是shi絕jue對dui穩wen定ding的de，確que實shi容rong易yi發fa生sheng染ran色se體ti丟diu失shi的de情qing況kuang，尤you其qi是shi當dang細xi胞bao移yi到dao新xin環huan境jing中zhong生sheng長chang，如ru從cong小xiao孔kong擴kuo大da到dao大da孔kong

，或huo者zhe複fu蘇su操cao作zuo時shi，更geng容rong易yi發fa生sheng陽yang性xing變bian為wei陰yin性xing。但dan是shi也ye有you一yi些xie辦ban法fa盡jin量liang減jian少shao陽yang性xing變bian為wei陰yin性xing的de辦ban法fa。一yi般ban可ke以yi從cong這zhe幾ji個ge方fang麵mian加jia以yi注zhu意yi：

 

（1）永(yong)遠(yuan)保(bao)證(zheng)細(xi)胞(bao)處(chu)在(zai)最(zui)佳(jia)的(de)生(sheng)長(chang)環(huan)境(jing)中(zhong)。尤(you)其(qi)是(shi)培(pei)養(yang)基(ji)不(bu)能(neng)長(chang)期(qi)不(bu)換(huan)
，一(yi)般(ban)來(lai)說(shuo)
，當(dang)細(xi)胞(bao)增(zeng)長(chang)到(dao)一(yi)定(ding)密(mi)度(du)的(de)時(shi)候(hou)，培(pei)養(yang)基(ji)就(jiu)開(kai)始(shi)變(bian)顏(yan)色(se)，這(zhe)個(ge)時(shi)候(hou)就(jiu)要(yao)準(zhun)備(bei)換(huan)培(pei)養(yang)基(ji)了(le)，除(chu)了(le)換(huan)培(pei)養(yang)基(ji)，同(tong)時(shi)應(ying)該(gai)控(kong)製(zhi)好(hao)細(xi)胞(bao)的(de)密(mi)度(du)，可(ke)以(yi)吹(chui)走(zou)過(guo)多(duo)的(de)細(xi)胞(bao)，使(shi)新(xin)加(jia)入(ru)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)不(bu)至(zhi)於(yu)很(hen)快(kuai)被(bei)消(xiao)耗(hao)。

 

（2）對於重要的細胞株
，每一步都把陽性的細胞保種。

 

（3）不要過於頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現死亡或者生長形態發生明顯變化。

 

（4）對於傳代次數較多的細胞株需要經常進行亞克隆，並將每一次的亞克隆株也作凍存。

 

（5）當細胞被支原體等微生物汙染
，也會發生由陽性轉為陰性的情況。

 

6.  為什麼我做亞克隆後長不出克隆來
？

 

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似

，但是除此之外，也還有一些獨特的原因。

 

（1）亞克隆時，原始孔裏的細胞狀態不好，經過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至於長不出克隆。

 

（2)亞(ya)克(ke)隆(long)時(shi)，沒(mei)有(you)按(an)照(zhao)正(zheng)確(que)的(de)數(shu)量(liang)取(qu)出(chu)細(xi)胞(bao)
，在(zai)本(ben)站(zhan)有(you)關(guan)亞(ya)克(ke)隆(long)操(cao)作(zuo)的(de)頁(ye)麵(mian)上(shang)提(ti)到(dao)過(guo)，亞(ya)克(ke)隆(long)的(de)過(guo)程(cheng)服(fu)從(cong)泊(bo)鬆(song)分(fen)布(bu)
，如(ru)果(guo)取(qu)出(chu)的(de)細(xi)胞(bao)遠(yuan)遠(yuan)低(di)於(yu)平(ping)均(jun)每(mei)孔(kong)一(yi)個(ge)細(xi)胞(bao)
，或(huo)有(you)效(xiao)細(xi)胞(bao)遠(yuan)遠(yuan)低(di)於(yu)平(ping)均(jun)每(mei)孔(kong)一(yi)個(ge)細(xi)胞(bao)，則(ze)也(ye)可(ke)能(neng)出(chu)現(xian)長(chang)不(bu)出(chu)克(ke)隆(long)的(de)結(jie)果(guo)。

 

（3）未添加飼養層細胞。單個細胞在完全培養基中極難培養

，如果不添加飼養層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。

 

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長並不是必須的

，但是HT確實可以加快細胞生長
，改善細胞生長狀態。

 

（5）使shi用yong無wu血xue清qing培pei養yang基ji。這zhe一yi點dian是shi很hen冷leng僻pi的de一yi個ge因yin素su。雖sui然ran很hen少shao有you人ren使shi用yong無wu血xue清qing培pei養yang基ji製zhi備bei單dan抗kang，但dan是shi在zai某mou些xie血xue清qing可ke能neng幹gan預yu篩shai選xuan步bu驟zhou的de實shi驗yan的de時shi候hou
，可ke能neng會hui選xuan用yong無wu血xue清qing培pei養yang基ji來lai培pei養yang雜za交jiao瘤liu，但dan是shi需xu要yao注zhu意yi的de是shi，在zai很hen多duo種zhong無wu血xue清qing培pei養yang基ji中zhong
，單dan個ge細xi胞bao是shi很hen難nan長chang成cheng克ke隆long的de。最zui好hao的de解jie決jue辦ban法fa就jiu是shi先xian用yong含han有you血xue清qing的de培pei養yang基ji培pei養yang它ta們men，等deng克ke隆long長chang出chu後hou再zai把ba培pei養yang基ji徹che底di更geng換huan為wei無wu血xue清qing培pei養yang基ji。

 

7.  為什麼我凍存的細胞很難複蘇或者複蘇不活
？ 

 

答：這個問題要從兩個方麵來回答

，一是凍存方麵，二是複蘇問題。 對於凍存過程，需要注意：

 

（1）dongcunyedepeifang。zhegewentihenguanjian
，yigelianghaodedongcunyepeifangkeyishixibaobaocundefeichanghao，eryigebuhaodedongcunyepeifangkenenghuirangxibaoqingkesiwang。muqianrenweibijiaohaodepeifangyou：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養過雜交瘤的培養基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的de含han量liang非fei常chang重zhong要yao，如ru果guo這zhe個ge濃nong度du過guo低di，則ze起qi不bu到dao保bao護hu作zuo用yong
，凍dong存cun的de細xi胞bao最zui終zhong會hui死si於yu冰bing晶jing形xing成cheng時shi的de張zhang力li
，如ru果guo濃nong度du過guo高gao
，則ze細xi胞bao中zhong毒du而er亡wang。如ru果guo使shi用yong第di二er個ge配pei方fang，注zhu意yi一yi定ding要yao用yong養yang過guo雜za交jiao瘤liu的de培pei養yang基ji，而er盡jin量liang不bu要yao用yong一yi般ban的de完wan全quan培pei養yang基ji，而er且qie一yi定ding是shi配pei養yang需xu要yao凍dong存cun的de那na一yi株zhu的de培pei養yang基ji。文wen獻xian中zhong也ye有you提ti到dao用yong甘gan油you作zuo為wei凍dong存cun保bao護hu劑ji的de，站zhan長chang自zi己ji沒mei有you親qin自zi試shi過guo，不bu發fa表biao評ping論lun。如ru果guo新xin手shou確que實shi對dui這zhe個ge沒mei把ba握wo，市shi場chang上shang也ye有you商shang品pin化hua的de凍dong存cun液ye，買mai回hui來lai按an照zhao說shuo明ming書shu操cao作zuo就jiuOK了。

 

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛
，則細胞膜很容易破，複蘇成活的機會就明顯會下降。

 

（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明
，以每分鍾1 ℃的速度下降凍存細胞是最理想的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然後再在-20 ℃放置1-2小時，最後轉入-80 ℃放置過夜
，最終轉入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現在市場上有比較貴的凍存盒
，把需要存放的細胞放進去，然後直接放-80 ℃就行
，等時間夠長後直接轉至液氮中即可。

 

（4）細xi胞bao需xu要yao保bao存cun在zai液ye氮dan的de氣qi相xiang中zhong，而er不bu是shi泡pao在zai液ye相xiang裏li。否fou則ze液ye氮dan很hen容rong易yi進jin入ru凍dong存cun管guan。這zhe一yi點dian很hen多duo人ren都dou沒mei有you注zhu意yi，大da部bu份fen人ren都dou是shi直zhi接jie往wang液ye相xiang裏li放fang
，其qi實shi這zhe是shi錯cuo誤wu的de。有you人ren認ren為wei，普pu通tong的de液ye氮dan中zhong可ke能neng含han有you微wei生sheng物wu或huo者zhe孢bao子zi什shen麼me的de，如ru果guo放fang在zai液ye相xiang中zhong，這zhe些xie微wei生sheng物wu或huo孢bao子zi就jiu有you機ji會hui進jin入ru凍dong存cun管guan
，最zui終zhong可ke能neng造zao成cheng細xi胞bao汙wu染ran。

 

（5）保證被凍存的細胞處於良好的生長狀態，並且沒有被汙染。 

 

對於複蘇過程，需要注意：

 

（1）快速。為了防止升溫中細胞內產生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水複蘇，並不斷晃動凍存管。

 

（2）複蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能汙染管口，造成複蘇的細胞被汙染。

 

（3）有的人複蘇細胞時，沒有去掉凍存液

，這樣就把凍存液裏的DMSO帶dai到dao了le新xin的de培pei養yang體ti係xi裏li
，容rong易yi對dui細xi胞bao造zao成cheng毒du害hai，因yin此ci強qiang烈lie建jian議yi將jiang融rong化hua的de細xi胞bao離li心xin後hou去qu掉diao凍dong存cun液ye
，然ran後hou用yong新xin的de完wan全quan培pei養yang基ji重zhong懸xuan，再zai接jie種zhong到dao新xin的de容rong器qi內nei培pei養yang。

 

8.  為什麼我的細胞總是汙染？如何可以救活汙染的細胞
？

 

答：養(yang)細(xi)胞(bao)出(chu)現(xian)汙(wu)染(ran)，幾(ji)乎(hu)是(shi)每(mei)個(ge)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)技(ji)術(shu)員(yuan)容(rong)易(yi)出(chu)現(xian)的(de)問(wen)題(ti)。要(yao)防(fang)止(zhi)細(xi)胞(bao)汙(wu)染(ran)，無(wu)非(fei)就(jiu)是(shi)保(bao)證(zheng)培(pei)養(yang)環(huan)境(jing)無(wu)汙(wu)染(ran)，保(bao)證(zheng)所(suo)用(yong)的(de)所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都(dou)無(wu)汙(wu)染(ran)源(yuan)，同(tong)時(shi)提(ti)高(gao)操(cao)作(zuo)時(shi)的(de)警(jing)惕(ti)性(xing)，這(zhe)些(xie)基(ji)本(ben)的(de)知(zhi)識(shi)這(zhe)裏(li)就(jiu)不(bu)再(zai)廢(fei)話(hua)了(le)。下(xia)麵(mian)講(jiang)一(yi)講(jiang)如(ru)何(he)挽(wan)救(jiu)一(yi)株(zhu)已(yi)經(jing)被(bei)汙(wu)染(ran)的(de)細(xi)胞(bao)株(zhu)。 

 

（1）體外用抗生素消滅。一般來說，一旦發現細胞被微生物汙染
，應該馬上進行處理
，也許還有一線挽救的機會。 但是這種挽救不是盲目的
，首先應該決斷是哪一類生物造成的汙染。細胞的汙染大致可以分三類：細菌汙染、真菌汙染和支原體汙染。 在顯微鏡下仔細觀察

，這三種微生物汙染區別還是比較明顯的：如果有大量運動的微生物，且形態較大，輪廓清晰可見，呈較大幅度運動

，並且培養基在短時間內變酸，則很可能是細菌汙染
；如果在顯微鏡下觀察有典型的斑狀或絲狀微生物（注意與塑料屑、棉花屑和琉璃纖維區別開），基本上看不到明顯的運動，則很可能是真菌汙染；如ru果guo看kan不bu到dao明ming顯xian的de微wei生sheng物wu
，並bing且qie培pei養yang基ji沒mei有you明ming顯xian的de顏yan色se上shang的de變bian化hua
，而er細xi胞bao狀zhuang態tai很hen差cha
，細xi胞bao邊bian緣yuan極ji其qi不bu光guang滑hua，而er且qie細xi胞bao又you莫mo名ming其qi妙miao地di死si亡wang或huo生sheng長chang極ji其qi緩huan慢man，則ze有you可ke能neng為wei支zhi原yuan體ti汙wu染ran，但dan不bu能neng下xia明ming確que的de結jie論lun，如ru果guo非fei常chang需xu要yao知zhi道dao是shi否fou為wei支zhi原yuan體ti汙wu染ran可ke以yi使shi用yong相xiang關guan的de試shi劑ji盒he進jin行xing檢jian測ce。 對dui於yu細xi菌jun或huo真zhen菌jun的de汙wu染ran，可ke以yi先xian把ba細xi胞bao收shou集ji起qi來lai
，用yong幹gan淨jing的de培pei養yang基ji洗xi滌di離li心xin
，交jiao替ti進jin行xing幾ji次ci

，再zai把ba洗xi幹gan淨jing的de細xi胞bao放fang在zai新xin的de培pei養yang板ban或huo培pei養yang瓶ping等deng容rong器qi內nei，加jia高gao濃nong度du的de抗kang生sheng素su培pei養yang，同tong時shi強qiang烈lie建jian議yi加jia入ru小xiao鼠shu腹fu腔qiang巨ju噬shi細xi胞bao作zuo為wei飼si養yang層ceng
，以yi輔fu助zhu消xiao除chu微wei生sheng物wu。對dui於yu細xi菌jun汙wu染ran，可ke以yi把ba青qing黴mei素su的de濃nong度du提ti高gao至zhi10倍左右
，鏈黴素濃度提高至5-10 倍
，也可以用10倍濃度的卡那黴素替代鏈黴素。 對於真菌汙染，可以在培養基中加入約5 ug/ml的咪康唑（注射用達克寧）抑製。 對dui於yu這zhe兩liang種zhong情qing況kuang的de汙wu染ran，采cai用yong上shang述shu方fang法fa處chu理li後hou，待dai細xi胞bao稍shao有you好hao轉zhuan
，並bing且qie沒mei有you發fa現xian更geng大da規gui模mo的de汙wu染ran時shi，需xu要yao盡jin快kuai重zhong複fu上shang麵mian的de處chu理li步bu驟zhou。需xu要yao注zhu意yi的de是shi，此ci時shi細xi胞bao生sheng長chang受shou抗kang生sheng素su的de影ying響xiang比bi較jiao大da故gu而er生sheng長chang很hen慢man。如ru果guo多duo次ci傳chuan代dai均jun未wei發fa現xian汙wu染ran複fu發fa，可ke以yi慢man慢man降jiang低di抗kang生sheng素su濃nong度du直zhi至zhi常chang規gui濃nong度du，確que定ding是shi否fou完wan全quan根gen除chu汙wu染ran。最zui好hao進jin行xing一yi次ci有you限xian稀xi釋shi的de亞ya克ke隆long操cao作zuo，以yi獲huo得de更geng加jia純chun淨jing的de細xi胞bao株zhu。 而對於支原體汙染
，則比較麻煩，一般的抗生素是很難解決的
，對於輕度的汙染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素和10 ug/mlzuoyoudehuanbingshaxingjiaotichuli。ruguodedaomingxiandehuanjie，jianyimashangzuoyakelongcaozuo，kankanshifoudedaowurangenchudexibaozhu，ruguocifangfawuxiao，zebunengdanchunliyongkangshengsulaijiejuewuranwenti。 

 

（2）tineifa。zhegebanfahenjiandan
，yuanlijiushidongwutiyouqiangdademianyixitong，yibandeweishengwudoukeyibeidongwutixiaomie。juticaozuohezhibeifushuidefangfawanquanyiyang，jixianyongIFA或huo石shi蠟la製zhi敏min小xiao鼠shu，數shu天tian後hou腹fu腔qiang注zhu射she汙wu染ran的de雜za交jiao瘤liu。如ru果guo情qing況kuang緊jin急ji

，致zhi敏min當dang天tian注zhu射she雜za交jiao瘤liu也ye行xing。一yi般ban十shi天tian後hou小xiao鼠shu產chan生sheng腹fu水shui，在zai超chao淨jing台tai無wu菌jun采cai出chu腹fu水shui
，其qi中zhong即ji含han有you大da量liang的de雜za交jiao瘤liu細xi胞bao
，一yi般ban是shi可ke以yi除chu掉diao汙wu染ran的de微wei生sheng物wu的de。也ye可ke以yi在zai小xiao鼠shu背bei部bu注zhu射she雜za交jiao瘤liu，十shi幾ji天tian後hou可ke以yi看kan到dao實shi體ti瘤liu形xing成cheng，也ye可ke以yi在zai超chao淨jing台tai上shang無wu菌jun采cai摘zhai，然ran後hou放fang回hui培pei養yang板ban或huo培pei養yang瓶ping等deng容rong器qi內nei培pei養yang。如ru果guo被bei汙wu染ran的de細xi胞bao很hen少shao，比bi如ru說shuo在zai96kongbanshangjiubeiwuranle
，zheshihoubunengjinxingfuqiangzhushe，yebuyaojinxingpixiazhushe
，fouzexibaohenrongyibeilaoshudemianyixitonggongjiersiwangde，zuihaodebanfashicaiyongpineizhushedefangfajinxing
，tongshizaifuqiangneiyongIFA或石蠟油致敏
，十幾天後，同樣可以形成腹水，其中即含有幹淨的雜交瘤細胞。 如果擔心小鼠會受到微生物感染，可以在培養基中先加入高濃度的抗生素，然後連同抗生素一起注射到小鼠體內。 

 

ruguoquedingxibaowuranjiqiyanzhong，bingqiexibaoyidamianjisiwang
，jianyifangqi，xunsuzuohaohuanjingqingjiegongzuo
，duixibaocaozuojianzuochedixiaodu
，zhongxinzuorongheerhuodexindexibaozhu，bukeyinxiaoshidazaochengqitadexibaoyebeiwuran。

 

9.  為什麼我的雜交瘤細胞不能製備腹水或者製備的腹水中沒的抗體或腹水沒有效價？

 

答： 不能製備腹水的原因大部份是人為的原因：

 

（1）致敏不正確
，例如使用了不正確的致敏劑
，或者致敏時間與接種雜交瘤的時間相差太久。

 

（2）雜交瘤的接種位置不正確，沒有打到腹腔

，而是打到了皮下。

 

（3）接種的雜交瘤細胞數量太少或者細胞狀態不好。一般不應少於10萬個細胞，建議在100萬個細胞左右為宜。

 

（4）製(zhi)備(bei)腹(fu)水(shui)小(xiao)鼠(shu)的(de)種(zhong)係(xi)與(yu)參(can)與(yu)融(rong)合(he)的(de)細(xi)胞(bao)來(lai)源(yuan)的(de)動(dong)物(wu)種(zhong)係(xi)相(xiang)差(cha)太(tai)遠(yuan)，以(yi)至(zhi)製(zhi)備(bei)腹(fu)水(shui)的(de)小(xiao)鼠(shu)對(dui)雜(za)交(jiao)瘤(liu)有(you)強(qiang)大(da)的(de)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)將(jiang)其(qi)殺(sha)死(si)，建(jian)議(yi)更(geng)換(huan)小(xiao)鼠(shu)品(pin)係(xi)重(zhong)新(xin)接(jie)種(zhong)。 

 

對於腹水沒有效價，可能的原因：

 

（1）製備腹水的雜交瘤極不穩定，打到小鼠身上之前就失去抗體分泌能力或者打到腹腔內就失去了分泌能力。

 

（2）致敏小鼠時采用了錯誤的致敏劑
，如使用了弗氏完全佐劑，這時即使不打雜交瘤
，小鼠也會產生腹水。

 

（3)極(ji)其(qi)罕(han)見(jian)的(de)情(qing)況(kuang)，就(jiu)是(shi)此(ci)雜(za)交(jiao)瘤(liu)生(sheng)產(chan)的(de)抗(kang)體(ti)可(ke)以(yi)與(yu)小(xiao)鼠(shu)體(ti)內(nei)的(de)分(fen)子(zi)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)，於(yu)是(shi)雜(za)交(jiao)瘤(liu)產(chan)生(sheng)的(de)抗(kang)體(ti)被(bei)小(xiao)鼠(shu)的(de)相(xiang)關(guan)蛋(dan)白(bai)中(zhong)和(he)，這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下(xia)，小(xiao)鼠(shu)的(de)身(shen)體(ti)可(ke)能(neng)會(hui)出(chu)現(xian)明(ming)顯(xian)的(de)異(yi)常(chang)。

 

（4）檢測腹水效價的實驗方案有問題
，或者腹水稀釋比過大。 

10.  免疫失敗的可能原因及應采取的措施

答：有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方麵找原因
，並改進之。

（1）免疫動物的種屬及品係是否合適，可考慮改變動物的種屬或品係，或擴大免疫動物的數量。

（2） 抗原質量是否良好

，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號
，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

（3） 製備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑
，載體、抗原或載體的比例
、反應時間等多方麵去考慮，並加以改進。

（4） 所用的佐劑是否合適
，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

（5） 免疫的方法、劑量
，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

（6） 動物的飼養是否得當，如營養（飼料
、飲水）、環境衛生（通風、采光、溫度）是否符合要求
，動物的健康情況是否良好等。

11.  製備單克隆抗體影響因素

、失敗原因分析

答：由於製備McAb的實驗周期長
，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。 其主要失敗原因和影響因素有：

（1）汙染： 包括細菌、黴mei菌jun和he支zhi原yuan體ti的de汙wu染ran。這zhe是shi雜za交jiao瘤liu工gong作zuo中zhong最zui辣la手shou的de問wen題ti。一yi旦dan發fa現xian有you黴mei菌jun汙wu染ran就jiu應ying及ji早zao將jiang汙wu染ran板ban棄qi之zhi
，以yi免mian汙wu染ran整zheng個ge培pei養yang環huan境jing。支zhi原yuan體ti的de汙wu染ran主zhu要yao來lai源yuan於yu牛niu血xue清qing，此ci外wai，其qi它ta添tian加jia劑ji、shiyanshigongzuorenyuanjihuanjingyekenengzaochengzhiyuantiwuran。zaiyoutiaojiandeshiyanshi，yaoduimeiyipixiaoniuxueqinghechangqichuandaipeiyangdexibaoxijinxingzhiyuantidejianzha
，zhachuwuranyuanyingjishicaiqucuoshichuli。duiyuwurandezajiaoliuxibaokeyicaiqushengwuxuedeguolvfangfa
，jiangwurandezajiaoliuxibaozhusheyuBALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體瘤時，取出分離雜交瘤細胞
，一般可除去支原體汙染。

（2）融合後雜交瘤不生長， 在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

PEG有毒性或作用時間過長。

牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴格的篩選。

骨髓瘤細胞汙染了支原體。

HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。

 

（3）雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體： 融合後有細胞生長
，但無抗體產生
，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變
，變成A抵抗細胞所致。 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 對於原分泌抗體的雜交瘤細胞變為陰性
，可能是細胞支原體汙染，或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而 抑製了抗體分泌細胞的生長。也可能發生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”
，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。

要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。

要定期進行再克隆。

三不要：

不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。

不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。

不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。

 

（4）雜交瘤細胞難以克隆化

可能與小牛血清質量

、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由於細胞有支原體汙染
，使克隆化難以成功。若是融合後的早期克隆化，應在培養液加HT。