—免疫親和層析淨化高效液相色譜法和熒光光度法

 

1 範圍

     本標準規定了免疫親和層析淨化—高效液相色譜法和免疫親和層析淨化—熒光光度法測定食品中黃曲黴毒素的條件和詳細分析步驟。

本標準適用於玉米
、花生及其製品（花生醬、花生仁

、花生米）、大米、小麥
、植物油脂、醬油、食醋等食品中黃曲黴毒素的測定。

樣品中黃曲黴毒素的檢出限：免疫親和層析淨化—高效液相色譜法和免疫親和層析淨化—熒光光度法為1mg/kg；免疫親和層析淨化—熒光光度法測定醬油樣品中黃曲黴毒素檢出限為2.5mg/kg。

 

2 免疫親和層析淨化高效液相色譜法

2.1 方法提要

    試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋後，濾液經過含有黃曲黴毒素特異抗體的免疫親和層析淨化
，此抗體對黃曲黴毒素B1
、B2、G1、G2具有專一性，黃曲黴毒素交聯在層析介質中的抗體上。用水或吐溫/PBS將jiang免mian疫yi親qin和he柱zhu上shang雜za質zhi除chu去qu，以yi甲jia醇chun通tong過guo免mian疫yi親qin和he層ceng析xi柱zhu洗xi脫tuo
，洗xi脫tuo液ye通tong過guo帶dai熒ying光guang檢jian測ce器qi的de高gao效xiao液ye相xiang色se譜pu儀yi柱zhu後hou碘dian溶rong液ye衍yan生sheng測ce定ding黃huang曲qu黴mei毒du素su的de含han量liang。

 

2.2 試劑和溶液

    除非另有規定，僅使用分析純試劑、重蒸餾水。

2.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

2.2.5 苯：色譜純

2.2.6乙腈：色譜純

2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

2.2.8氯化鈉（NaCl）

2.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

2.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

GB/T 18979-2003

 

2.2.11氯化鉀（KCl）

2.2.12  PBS緩衝溶液：稱取8.0g氯化鈉
，1.2g磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，0.2g氯化鉀
，用990mL純水溶解，然後用濃鹽酸調節pH值至7.0，最後用純水稀釋至1000mL。

2.2.13  吐溫-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐溫-20
，加入PBS緩衝溶液並定容至1000mL。

2.2.14  pH7.0磷酸鹽緩衝溶液：取25.0mL 0.2mol/L的磷酸二氫鉀溶液與29.1mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液混勻後
，稀釋到100 mL。

2.2.15 黃曲黴毒素標準品（黃曲黴毒素B1、B2、G1、G2）：純度≥99%。

2.2.16 黃曲黴毒素標準貯備溶液：用苯-乙腈（98+2）溶液分別配製0.100mg/mL的黃曲黴毒素B1
、B2、G1、G2標準貯備液
，保存於4ºC備用。

2.2.17 黃曲黴毒素混合標準工作液：準確移取適量的黃曲黴毒素B1、B2、G1
、G2標準貯備液，用苯-乙腈（98+2）溶液稀釋成混合標準工作液。

2.2.18 柱後衍生溶液（0.05%碘溶液）：稱取0.1g碘，溶解於20mL甲醇後，加純水定容至200mL
，以0.45μm的尼龍濾膜過濾，4℃避光保存。

 

2.3 儀器和設備

    實驗室常規儀器、設備
、材料及下列各項。

2.3.1 高速均質器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.2 黃曲黴毒素免疫親和柱。

2.3.3 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.4 玻璃注射器：10 mL
，20mL。

2.3.5 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。

2.3.6 高效液相色譜儀：具有360nm激發波長和大於420nm發射波長的熒光檢測器。

2.3.7 空氣壓力泵。

2.3.8 微量注射器：100mL。

2.3.9 色譜柱：C18柱（柱長150 mm 
，內徑4.6mm
，填料直徑5mm）。

 

2.4 分析步驟

2.4.1提取

2.4.1.1大米、玉米、小麥
、花生及其製品：準確稱取經過磨細（粒度小於2mm）的試樣25.0g於250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及準確加入125.0mL（ ）甲醇-水（7+3）
，以均質器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾
，準確移取15.0mL（ ）濾液並加入30.0mL（ ）水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.2 植物油脂：準確稱取試樣25.0g於250mL具塞錐形瓶中
，加入5.0g氯化鈉及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL（ ），以均質器高速攪拌提取2min。定量濾紙過濾，準確移取15.0mL（ ）濾液並加入30.0mL（ ）水稀釋
，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次
，至濾液澄清，備用。

2.4.1.3 醬油：稱取試樣50.0g於250.0mL具塞錐形瓶中
，加入2.5g氯化鈉及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL（ ），以均質器高速攪拌提取1min。定量濾紙過濾，準確移取10.0mL（ ）濾液並加入40.0mL（ ）水稀釋
，用玻璃纖維濾紙過濾1~2次，至濾液澄清，備用。

2.4.1.4 食醋：準確稱取5.0g樣品，加入1.0g氯化鈉，以pH7.0磷酸鹽緩衝溶液稀釋至25.0mL（ ）
，混勻，定量濾紙過濾。取10.0mL（ ）濾液加入10.0mL（ ）緩衝液，混勻。以玻璃纖維濾紙過濾1~2 次，至濾液澄清，備用。

2.4.2 淨化

2.4.2.1 大米、玉米
、小麥、花生及其製品、植物油脂： 將免疫親和柱連接於20.0mL玻璃注射器下。準確移取15.0mL（ ）樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2~3mL空氣通過柱體。以10.0mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，並使2mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1 mL/min ~2mL/min
，收集全部洗脫液於玻璃試管中，供檢測用。

2.4.2.2 醬油： 將免疫親和柱連接於10.0mL玻璃注射器下。準確移取10mL（ ）醬油樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱。用10.0mL 0.1%的吐溫/PBS清洗
，再以10.0mL水清洗柱子2次，棄去全部流出液，並使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫，流速為1mL/min~2mL/min

，收集全部洗脫液於玻璃試管中，供檢測用。

2.4.2.3食醋： 將免疫親和柱連接於10.0mL玻璃注射器下。準確移取10.0mL（ ）食醋樣品提取液注入玻璃注射器中
，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調節壓力使溶液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，用10mL 0.1%的吐溫/PBS溶液清洗
，再以10.0mL水清洗柱子2次

，棄去全部流出液，並使2 mL~3mL空氣通過柱體。準確加入1.0mL（ ）色譜級甲醇洗脫

，流速為1 mL/min ~2mL/min
，收集全部洗脫液於玻璃試管中，供檢測用。

2.4.3測定

2.4.3.1    高效液相色譜條件

流動相：甲醇-水（45+55）

流速：0.8mL/min

柱後衍生化係統

衍生溶液：0.05%碘溶液

衍生溶液流速：0.2mL/min

反應管溫度：70°C

反應時間：1min

2.4.3.2    定量

用進樣器吸取100mL黃曲黴毒素標準工作液（2.2.17）注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標準溶液的響應值（峰高或峰麵積），得到黃曲黴毒素B1
、B2
、G1、G2標準溶液高效液相色譜圖。參考譜圖見圖1。

   

 

 

圖1  黃曲黴毒素B1, B2, G1, G2的標準譜圖

 

取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0mL，用進樣器吸取100mL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰麵積）。經過與黃曲黴毒素標準液譜圖比較響應值得到試樣中黃曲黴毒素B1、B2、G1和G2的濃度 。

2.4.4 空白試驗

    用水代替試樣，按2.4.1~2.4.3步驟做空白試驗。

2.4.5 結果計算

檢測結果按公式（1）計算：

                        …………（1）

      

式中： — 試樣中黃曲黴毒素（B1
、B2、G1或G2）的含量
，mg/kg；

      — 試樣中黃曲黴毒素B1、B2、G1或G2的含量
，mg/L；

      — 空白試驗黃曲黴毒素B1、B2
、G1或G2的含量
，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終淨化洗脫液所含的試樣質量，g；

      — 試樣稱取量，g

；

      — 樣品和提取液總體積
，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL
；

      — 稀釋液體積
，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。

    黃曲黴毒素總量為B1、B2
、G1、G2個別濃度之和，即B1+B2+G1+G2。

注：計算結果需扣除空白值。

計算結果表示到小數點後2位。

 

3 免疫親和層析淨化熒光光度法

3.1 方法提要

試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋後，濾液經過含有黃曲黴毒素特異抗體的免疫親和層析淨化
，此抗體對黃曲黴毒素B1、B2
、G1、G2具(ju)有(you)專(zhuan)一(yi)性(xing)

，黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)交(jiao)聯(lian)在(zai)層(ceng)析(xi)介(jie)質(zhi)中(zhong)的(de)抗(kang)體(ti)上(shang)。用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)將(jiang)免(mian)疫(yi)親(qin)和(he)柱(zhu)上(shang)雜(za)質(zhi)除(chu)去(qu)，以(yi)甲(jia)醇(chun)通(tong)過(guo)免(mian)疫(yi)親(qin)和(he)層(ceng)析(xi)柱(zhu)洗(xi)脫(tuo)，加(jia)入(ru)溴(xiu)溶(rong)液(ye)衍(yan)生(sheng)，以(yi)提(ti)高(gao)測(ce)定(ding)靈(ling)敏(min)度(du)。洗(xi)脫(tuo)液(ye)通(tong)過(guo)熒(ying)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)測(ce)定(ding)黃(huang)曲(qu)黴(mei)毒(du)素(su)（B1+B2+G1+G2）總量。

3.2 試劑和溶液

3.2.1甲醇（CH3OH）：色譜純

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色譜純         不要去掉

3.2.6乙腈：色譜純

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化鈉（NaCl）

3.2.9磷酸氫二鈉（Na2HPO4）

3.2.10磷酸二氫鉀（KH2PO4）

3.2.11氯化鉀（KCl）

3.2.12  溴溶液儲備液（0.01%）：稱取適量溴，溶於水，配成0.01%的儲備液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混勻，於棕色瓶中保存備用。需每次使用前配製。

3.2.14      二水硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）

3.2.15  硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻後定容至1000mL。

3.2.16  熒光光度計校準溶液：稱取3.40g硫酸奎寧（C20H24N2O2×H2SO4×2H2O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液熒光光度計讀數相當於20 mg/L黃曲黴毒素標準溶液。

3.3 儀器和設備

3.3.1 熒光光度計

2.3.2 高速均質器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黃曲黴毒素免疫親和柱。

2.3.4 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。

2.3.7 空氣壓力泵。

3.4 分析步驟

3.4.1提取

同本標準2.4.1。

3.4.2 淨化

同本標準2.4.2。

3.4.3測定

3.4.3.1    熒光光度計校準

    在激發波長360nm，發射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的讀數值為0.0 mg/L；以熒光光度計校準溶液（3.2.16）調節熒光光度計的讀數值為20.0 mg/L。

3.4.3.2    樣液測定

取上述淨化後的甲醇洗脫液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混勻
，靜置1min
，按3.4.3.1條件進行操作，於熒光光度計中讀取樣液中黃曲黴毒素（B1+B2+G1+G2）的濃度 （mg/L）。

3.4.4空白試驗

用水代替試樣，按3.4.1~3.4.3步驟做空白試驗。

3.4.5結果計算

檢測結果按公式（2）計算：

                        …………（2）

      

式中： — 試樣中黃曲黴毒素（B1、B2
、G1或G2）含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲黴毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L；

      — 空白試驗黃曲黴毒素B1、B2、G1或G2的含量，mg/L
；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終淨化洗脫液所含的試樣質量

，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積
，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。注：計算結果需扣除空白值。

        計算結果表示到小數點後1位。