1.從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩衝液（I）（不含DTT,不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管）,置室溫溶解.

2.在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻.

3.從小管中取出400ml水化上樣緩衝液,加入100ml樣品,充分混勻.

4.從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條（17cm pH 4-7）,室溫中放置10分鍾.

5.沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品.在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液一定要連貫.注意：不要產生氣泡.否則影響到膠條中蛋白質的分布.

6.當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中後,用鑷子輕輕的去除預製IPG膠條上的保護層.

7.分清膠條的正負極,輕輕地將IPG膠條膠麵朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正極（標有+）對應於聚焦盤的正極.確保膠條與電極緊密接觸.不要使樣品溶液弄到膠條背麵的塑料支撐膜上,因為這些溶液不會被膠條吸收.同樣還要注意不使膠條下麵的溶液產生氣泡.如果已經產生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的一端,上下移動膠條,直到氣泡被趕到膠條以外.

8.在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油,防止膠條水化過程中液體的蒸發.需緩慢的加入礦物油,沿著膠條,使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上.

9.對好正、負極,蓋上蓋子.設置等電聚焦程序.

10.聚焦結束的膠條.立即進行平衡
、第二向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置於樣品水化盤中,-20℃冰箱保存.

（二）第二向SDS-PAGE電泳

1.配製10%的丙烯酰胺凝膠兩塊.配80ml凝膠溶液,每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板夾層中,上部留1cm的空間,用MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇封麵,保持膠麵平整.聚合30分鍾.一般凝膠與上方液體分層後,表明凝膠已基本聚合.

2.待凝膠凝固後,倒去分離膠表麵的MilliQ水

、乙醇或水飽和正丁醇,用MilliQ水衝洗.

3.從-20℃冰箱中取出的膠條,先於室溫放置10分鍾,使其溶解.

4.配製膠條平衡緩衝液I.

5．在桌上先放置幹的厚濾紙,聚焦好的膠條膠麵朝上放在幹的厚濾紙上.將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多餘水分,然後直接置於膠條上,輕輕吸幹膠條上的礦物油及多餘樣品.這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋.

6.將膠條轉移至溶漲盤中,每個槽一根膠條,在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩衝液I.將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鍾.

7.配製膠條平衡緩衝液II.

8.第一次平衡結束後,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液I.並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表麵）.再加入膠條平衡緩衝液II,繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鍾.

9.用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體.將處理好的第二向凝膠放在桌麵上,長玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝膠的頂慷宰拋約骸?br>

10.將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解.

11.將10×電泳緩衝液,用量筒稀釋10倍,成1×電泳緩衝液.趕去緩衝液表麵的氣泡.

12.第二次平衡結束後,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液II.並用濾紙吸取多餘的平衡液（將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表麵）.

13.將IPG膠條從樣品水化盤中移出,用鑷子夾住膠條的一端使膠麵完全浸末在1×電泳緩衝液中.然後將膠條膠麵朝上放在凝膠的長玻璃板上.其餘膠條同樣操作.

14.將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上,短玻璃板一麵對著自己.在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液.

15.用鑷子
、壓舌板或是平頭的針頭,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯酰胺凝膠膠麵完全接觸.注意不要在膠條下方產生任何氣泡.在用鑷子
、壓舌板或平頭針頭推膠條時,要注意是推動凝膠背麵的支撐膜,不要碰到膠麵.

16.放置5分鍾,使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固.

17.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固後.將凝膠轉移至電泳槽中.

18.在電泳槽加入電泳緩衝液後,接通電源,起始時用的低電流（5mA/gel/17cm）或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成一條線後,再加大電流（或電壓）（20-30mA/gel/17cm）,待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳.

19.電泳結束後,輕輕撬開兩層玻璃,取出凝膠,並切角以作記號（戴手套,防止汙染膠麵）.

20.進行染色.