【目的】
研究基因的表達和調控時,需要從組織或細胞中分離純化RNA。RNA質量的高低經常影響RT-PCR、cDNA庫構建和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。
【主要試劑】
Trizol是一種新型總RNA抽提試劑,內含異硫氰酸胍等物質,能迅速破碎細胞,抑製細胞釋放出的核酸酶。
1. Trizol試劑含有苯酚,具有毒性和刺激性,注重操作。
2. RNase汙染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉,注重配帶手套,樣品盡可能蓋嚴。
3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最後得率,因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之後要看不見顆粒狀物質(結締組織和骨除外)。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作,防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。
4. 酵母和一些細菌由於細胞壁的特別結構,可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠並劇烈振蕩,使細胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
【預備工作】
RNA酶(Rnase)是導致RNA降jiang解jie最zui主zhu要yao的de物wu質zhi。此ci酶mei非fei常chang穩wen定ding,在zai一yi些xie極ji端duan的de條tiao件jian下xia隻zhi可ke暫zan時shi失shi活huo,但dan限xian製zhi因yin素su去qu除chu後hou又you迅xun速su恢hui複fu活huo性xing。常chang規gui高gao溫wen高gao壓ya滅mie菌jun方fang法fa和he蛋dan白bai抑yi製zhi劑ji不bu能neng使shi所suo有you的deRnase完全失活。
1.它廣泛存在於人的皮膚上,因此製備RNA時必須戴手套
2.RNase的又一汙染源是取液器。根據取液器製造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以DEPC配製的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部,可基本達到要求。
3. 塑料製品、玻璃和金屬物品的處理
塑料製品:盡量使用一次性無菌塑料製品。已標明RNase-free的塑料製品,如沒有開封使用過,通常不必再處理。
處理的步驟如下:
(1)在玻璃燒杯中注入去離子水,加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強的劇毒物,須在通風櫥中小心使用)
(2)將待處理的塑料製品放入一個可以高溫滅菌的容器中,注入DEPC-H2O,使塑料製品的所有部分都浸泡到溶液中,在通風櫃中37℃ 或室溫下處理過夜。
(3)將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中,將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料製品的容器以鋁箔封口,高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鍾。
(4)滅菌塑料製品烘烤幹燥,置潔淨處備用。
(5)玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上。
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