DNA序列測定是分子生物學領域最重要的技術之一，是了解基因結構和功能的基礎。DNA測序技術的不斷完善和儀器自動化程度的不斷提高，為大型基因組測序奠定了基礎，當今大多數蛋白質序列都是通過基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。DNA測序方法主要有雙脫氧鏈終止法（Sanger法）和化學降解法（Maxam-Gilbert法）。目前不管是傳統的手工測序法，還是儀器自動測序法均使用前者
，而儀器自動測序法以其快速、準確等優點得以廣泛應用。我室於1995年，引進美國PE公司的373A型DNA序列測定儀，儀器專管共用，兩年來為校內、外科研人員提供測序服務，現將該儀器使用中的一點體會報告如下。

1、測序原理和特點

373A型DNA測序儀使用雙脫氧鏈終止法（Dye-primer或Dye-terminator）進行DNA測序反應，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離
，實時檢測自動讀序。該儀器與其它儀器相比較，其顯著特點是它能用4種不同的熒光分子分別標記4種反應引物（Dye-primer法）或4種dNTP（Dye-terminator法）。4個反應分開進行，產物合並在一個泳道中電泳分離
，根據每條區帶的熒光不同加以識別讀序，這樣不但可提高每次分析樣品的數量（373A型每次可測定36個樣品）
，又克服了泳道間差異造成的讀序誤差。與傳統的手工測序比較：①安全，無汙染；用熒光素代替同位素
，避免了放射性同位素的汙染和對人體的危害
；②模板用量大大減小
，單鏈DNA模板用量為0.4μg，雙鏈DNA質粒模板用量為0.8μg
，PCR產物用量為5ng～20ng
；③測序長度大大提高
，一般可達450bp～500bp。

2、體會

2.1　模板純化是前提　DNA測序所用的模板可以是質粒DNA，也可以是PCR產物，但使用高質量的模板是測序成功的前提。DNA純化的方法很多
，如聚乙二醇沉澱法、瓊脂糖凝膠電泳法

、氯化銫梯度離心法、高效液相色譜法（HPLC法）和一次性微柱法等。用這些方法純化的DNA都可用於DNA測序，但從我們實驗結果來看，HPLC法和微柱法（如Promega公司的Wizard Plus Miniprep DNA Purification System）效果最好。為了保證測序的成功率，測序模板純化後

，必須先進行1%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠中含0.5mg/L溴化乙錠，樣品濃度為0.2g/L，上樣量為1μl）鑒定其純度，要求條帶清晰，無雜帶
，無拖尾
，否則應重新純化，以保證測序的結果。

2.2　測序反應是關鍵　測序反應是DNA自動測序的第一步，也是測序成敗的關鍵所在。符合測序要求的DNA模板
，經過測序反應後,會形成數百條帶有不同熒光的核苷酸鏈
，且每條核苷酸鏈的堿基數隻相差1個堿基。目前，我們使用的測序試劑為PE公司提供的DNA測序試劑盒（Dye-primer或Dye-ter-minator）
，其中每種試劑的濃度為產品的最佳組合，而且測序反應的條件（變性、退火、延伸的時間和溫度）與試劑盒配套使用。這就必須按照試劑盒的要求控製好模板的濃度，即使純度合格的DNA模板其濃度也很重要，單鏈DNA模板為0.10g/L，雙鏈質粒模板為0.20g/L
，PCRchanwugenjuqipianduandechangduqushidangdeliang，nongduguogaohuoguodidouhuizhijieyingxiangcexudejieguo。genjuwomendeshiyongqingkuang
，nongdutaigaoshi
，dianyongtiaodaixinhaoqiang
，huichuxianpingtoufeng，cexujieguoduan（一般＜250bp），而且誤差大
；濃度過低時，電泳條帶信號弱


，噪聲多
，誤差大，可信度差。在使用Dye-termina-tor法測序時（一般模板為PCR產物）
，除模板的純度和濃度符合要求外，所用引物的純度和濃度也很重要，引物應為測序級純度
，濃度應準確定量。

2.3　電泳條件是保證　前麵已提到，測序反應產物經電泳分離後,實時進行自動讀序，要使隻差1個堿基的DNA鏈達到最佳分離，電泳的條件至關重要。373A型DNA測序儀使用的是尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為4.75%
，恒功率（30W），zhexietiaojianxiangduiguding，suoyidianyongdechengbaizhuyaoqujueyuningjiaodepeizhi。yishidianyongshijidechundu。youyugaixitongshijianceyingguangxinhao，suoyiyaoqiushijibunenghanyouzazhi


，womenshiyongSigma公(gong)司(si)的(de)試(shi)劑(ji)和(he)部(bu)分(fen)國(guo)產(chan)分(fen)析(xi)純(chun)試(shi)劑(ji)，經(jing)實(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)可(ke)以(yi)達(da)到(dao)實(shi)驗(yan)的(de)要(yao)求(qiu)。二(er)是(shi)凝(ning)膠(jiao)配(pei)製(zhi)。要(yao)求(qiu)各(ge)種(zhong)試(shi)劑(ji)的(de)稱(cheng)量(liang)要(yao)準(zhun)確(que)，除(chu)凝(ning)膠(jiao)濃(nong)度(du)準(zhun)確(que)外(wai)，TBE緩衝液的配製尤為重要，否則會影響電泳結果
，造成測序失敗，這是由於TBE的離子濃度的高低可直接引起電泳時電壓的升高或降低。三是灌膠要仔細。要防止產生氣泡、波浪紋等而影響電泳分離。

總之
，在使用全自動DNA測序儀時，模板的純度和濃度、測序反應、電泳分離等環節都會影響測序的結果
，任何一個環節出現問題
，都會造成前功盡棄。根據我們的經驗，在測序試劑盒質量有保證
、儀器工作正常、實(shi)驗(yan)人(ren)員(yuan)精(jing)心(xin)操(cao)作(zuo)的(de)前(qian)提(ti)下(xia)，測(ce)序(xu)模(mo)板(ban)的(de)純(chun)度(du)和(he)濃(nong)度(du)是(shi)測(ce)序(xu)成(cheng)功(gong)的(de)關(guan)鍵(jian)
，測(ce)序(xu)失(shi)敗(bai)往(wang)往(wang)是(shi)由(you)於(yu)模(mo)板(ban)的(de)純(chun)度(du)不(bu)夠(gou)或(huo)濃(nong)度(du)不(bu)準(zhun)所(suo)致(zhi)。兩(liang)年(nian)來(lai)中(zhong)我(wo)們(men)測(ce)定(ding)了(le)數(shu)百(bai)份(fen)樣(yang)品(pin)，成(cheng)功(gong)率(lv)達(da)到(dao)88%。其中Dye-primer法測定的樣品占95%
，單鏈DNA模板單向測序可達700bp～800bp，雙鏈質粒模板單向測序可達500bp～600bp。