生物科學正迅速地演變為一門信息科學。最明顯的一個例子就是目前正在進行的HGP（human genome project），最終要搞清人類全部基因組的30億左右堿基對的序列。除了人的遺傳信息以外，還有其它生物尤其是模式生物（model organism）已經或正在被大規模測序，如大腸杆菌、啤酒酵母、秀xiu麗li隱yin杆gan線xian蟲chong以yi及ji中zhong國guo和he日ri本ben科ke學xue家jia攻gong關guan的de水shui稻dao基ji因yin組zu計ji劃hua。但dan單dan純chun知zhi曉xiao生sheng物wu基ji因yin組zu序xu列lie一yi級ji結jie構gou還hai遠yuan遠yuan不bu夠gou，還hai必bi須xu了le解jie其qi中zhong基ji因yin是shi怎zen樣yang組zu織zhi起qi來lai的de，每mei個ge基ji因yin的de功gong能neng是shi什shen麼me，又you是shi怎zen樣yang隨sui發fa育yu調tiao控kong和he微wei環huan境jing因yin素su的de影ying響xiang而er在zai特te定ding的de時shi空kong域yu中zhong展zhan開kai其qi表biao達da譜pu的de，即ji我wo們men正zheng由you結jie構gou基ji因yin組zu時shi代dai邁mai入ru功gong能neng基ji因yin組zu時shi代dai。隨sui著zhe這zhe個ge功gong能neng基ji因yin組zu學xue問wen題ti的de提ti出chu（後基因組時代，蛋白組學）[1]，湧現出許多功能強大的研究方法和研究工具，最突出的就是細胞蛋白質二維凝膠電泳（2-D-gel）（及相應的質譜法測蛋白分子量）和生物芯片（Biochip）技術[2]。
一． 什麼是基因芯片
生物芯片，簡單地說就是在一塊指甲大小（1cm3）的有多聚賴氨酸包被的矽片上或其它固相支持物（如玻璃片、矽片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表麵衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）並與保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表麵帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子，通常需包被以氨基矽烷或多聚賴氨酸等）將生物分子探針（寡核苷酸片段或基因片段）以大規模陣列的形式排布，形成可與目的分子（如基因）相互作用，交行反應的固相表麵，在激光的順序激發下標記熒光根據實際反應情況分別呈現不同的熒光發射譜征，CCD相機或激光共聚焦顯微鏡根據其波長及波幅特征收集信號，作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。生物芯片包括基因芯片、蛋白質芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無數預先設計好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成點陣，與樣品中同源核酸分子雜交[3]的芯片。
基因芯片的基本原理同芯片技術中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH）。即任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解為一個序列固定、錯落而重疊的寡核苷酸，又稱亞序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5個8 nt亞序列：
(1) CTCATATG
(2) GCTCATAT
(3) AGCTCATA
(4) TAGCTCAT
(5) TTAGCTCA
這5個亞序列依次錯開一個堿基而重疊7個堿基。亞序列中A、T、C、G 4個堿基自由組合而形成的所有可能的序列共有65536種。假如隻考慮完全互補的雜交，那麼48個8 nt亞序列探針中，僅有上述5個能同靶DNA雜交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針與一個未知的熒光標記DNA/RNA序列雜交，通過對雜交熒光信號檢測，檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸，從而推出靶DNA中的所有8 nt亞序列，最後由計算機對大量熒光信號的譜型（pattern）數據進行分析，重構靶DNA 的互補寡核苷酸序列。
二．芯片類型
一般基因芯片按其材質和功能，基本可分為以下幾類[4]
(一)元件型微陣列芯片
1生物電子芯片
2凝膠元件微陣列芯片
3藥物控釋芯片
(二) 通道型微陣列芯片
1毛細管電泳芯片
2 PCR擴增芯片
3集成DNA分析芯片
4毛細管電層析芯片
(三)生物傳感芯片
1光學纖維陣列芯片
2白光幹涉譜傳感芯片
小鼠基因表達譜芯片(MGEC)
附:目前國內基因芯片常見品種.(上海博星公司)
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芯片品種 |
芯片點數 |
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MGEC-20S |
2000 |
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MGEC-40S |
4000 |
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MGEC-80S |
8000 |
癌症相關基因表達譜芯片(CRGEC)
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分類 |
芯片型號 |
芯片點數 |
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肝癌相關基因表達譜芯片 |
LiverC-16S |
1626 |
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LiverC-16D |
3252 |
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LiverC-9.5NS |
954 |
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LiverC-9.5ND |
1908 |
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肺癌相關基因表達譜芯片 |
LungC-7.3S |
737 |
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LungC-7.3D |
1474 |
人類基因表達譜芯片(HGEC)
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芯片品種 |
芯片點數 |
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HGEC-10S |
1024 |
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HGEC-10D |
2048 |
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HGEC-20S |
2048 |
|
HGEC-20D |
4096 |
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HGEC-40S |
4096 |
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HGEC-40D |
8192 |
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HGEC-80S |
8192 |
|
HGEC-80D |
16184 |
三 基因芯片的製備
芯片種類較多，製備方法也不盡相同，常見的芯片可分為兩大類：一類是原位合成；一種是直接點樣。原位合成適用於寡核苷酸；直接點樣多用於大片段DNA，有時也用於寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光蝕刻法；一是噴印法。光蝕刻法可以合成30nt左右，噴印法可以合成40-50nt，光蝕刻法每步縮合率較低，一般為95%左右，合成30nt產率僅20%；噴印法可達99%以上，合成30nt產率可達74%，congzhegeyiyishangshuopenyinfateyixingyingbiguangkefagao。ciwai，penyinfabuxuteshudehechengshiji。yuyuanweihechengfabijiaodianyangfajiaojiandan，zhixujiangyuxianzhibeihaodeguahegansuanhuocDNA等樣品通過自動點樣裝置點於經特殊處理的玻璃片或其它材料上即可。
1 原位光蝕刻合成[5-7] 寡聚核苷酸原位光蝕刻合成技術是由Affymetrix公司開發的，采用的技術原理是在合成堿基單體的5'羥基末端連上一個光敏保護基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護，然後一個5'端duan保bao護hu的de核he苷gan酸suan單dan體ti連lian接jie上shang去qu，這zhe個ge過guo程cheng反fan複fu進jin行xing直zhi至zhi合he成cheng完wan畢bi。使shi用yong多duo種zhong掩yan蓋gai物wu能neng以yi更geng少shao的de合he成cheng步bu驟zhou生sheng產chan出chu高gao密mi度du的de陣zhen列lie，在zai合he成cheng循xun環huan中zhong探tan針zhen數shu目mu呈cheng指zhi數shu增zeng長chang。某mou一yi含hann個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個化學步驟能合成出4n個可能結構。例如：一個完整的十核苷酸通過32個化學步驟，8個小時可能合成65,536個探針。
目前美國Affymetrix公司已有同時檢測6,500個已知人類基因的DNA芯片，並且正在製備含500,000-1,000,000個寡核苷酸探針的人類基因檢測芯片。該公司每月投入基因芯片研究的經費約100萬wan美mei元yuan，目mu前qian產chan品pin尚shang未wei公gong開kai投tou放fang市shi場chang發fa揮hui經jing濟ji效xiao益yi，但dan已yi有you許xu多duo公gong司si及ji研yan究jiu機ji構gou與yu其qi簽qian約yue購gou買mai其qi產chan品pin。該gai產chan品pin不bu僅jin可ke用yong於yu基ji因yin表biao達da分fen析xi和he基ji因yin診zhen斷duan等deng，而er且qie在zai大da規gui模mo藥yao物wu開kai發fa方fang麵mian也ye具ju有you誘you人ren的de前qian景jing。Affymetrix的大部分產品將在98年nian底di全quan麵mian投tou放fang市shi場chang。屆jie時shi，在zai其qi產chan品pin被bei廣guang泛fan采cai用yong的de同tong時shi，其qi所suo有you的de研yan究jiu投tou入ru將jiang變bian成cheng巨ju大da的de利li潤run。其qi它ta公gong司si產chan品pin也ye正zheng在zai從cong實shi驗yan室shi技ji術shu研yan究jiu走zou向xiang開kai發fa應ying用yong。目mu前qian，用yong於yu分fen子zi診zhen斷duan的deDNA芯片不僅已可用於檢測愛滋病病毒基因還可用於囊性纖維化（CF）、乳腺癌、luanchaoaidengjibingxiangguanjiyindejiyinzhenduan。jianyuguangkeshebeijishufuza，zhinengyouzhuanyehuagongsishengchan，jiazhichengbengaojihechengxiaolvbugaodewenti，yinciyoudaijinxingyixiayanjiu：⑴對光刻技術進行改進，提高合成效率；⑵開發新的原位合成技術，如噴印合成技術，該技術既能進行原位合成又能進行非原位合成。
另一方法是光導原位合成法。具體方法是在經過處理的載玻片表麵鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護基團，可用光照除去，用特製的光刻掩膜（photolithographic mask）baohubuxuyaohechengdebuwei，erbaoluhechengbuwei，zaiguangzuoyongxiaquchuqiangjishangdebaohujituan，youliqiangji，liyonghuaxuefanyingjiashangdiyigehegansuan，suojiahegansuanzhongleijizaixinpianshangdebuweiyuxiansheding，suoyinrudehegansuandaiyouguangminbaohujituan，yibianxiayibuhecheng。ranhouanshangshufangfazaiqitaweidianjiashanglingwaisanzhonghegansuanwanchengdiyiweihegansuandehecheng，yinerN個核苷酸長的芯片需要4N個步驟。每一個獨特序列的探針稱為一個“feature”，這樣的芯片便具有4N個“feature”，包含了全部長度為N的核苷酸序列。這種原位直接合成的方法無須製備處理克隆和PCR產物，但是每輪反應所需設計的光柵則是主要的經費消耗。運用這種方法製作的芯片密度可高達106探針/平方厘米，即探針間隔為 5－10μm，但隻能製作II型 DNA芯片。見圖一。
2 原位噴印合成 芯(xin)片(pian)原(yuan)位(wei)噴(pen)印(yin)合(he)成(cheng)原(yuan)理(li)與(yu)噴(pen)墨(mo)打(da)印(yin)類(lei)似(si)，不(bu)過(guo)芯(xin)片(pian)噴(pen)印(yin)頭(tou)和(he)墨(mo)盒(he)有(you)多(duo)個(ge)，墨(mo)盒(he)中(zhong)裝(zhuang)的(de)是(shi)四(si)種(zhong)堿(jian)基(ji)等(deng)液(ye)體(ti)而(er)不(bu)是(shi)碳(tan)粉(fen)。噴(pen)印(yin)頭(tou)可(ke)在(zai)整(zheng)個(ge)芯(xin)片(pian)上(shang)移(yi)動(dong)並(bing)根(gen)據(ju)芯(xin)片(pian)上(shang)不(bu)同(tong)位(wei)點(dian)探(tan)針(zhen)的(de)序(xu)列(lie)需(xu)要(yao)將(jiang)特(te)定(ding)的(de)堿(jian)基(ji)噴(pen)印(yin)在(zai)芯(xin)片(pian)上(shang)特(te)定(ding)位(wei)置(zhi)。該(gai)技(ji)術(shu)采(cai)用(yong)的(de)化(hua)學(xue)原(yuan)理(li)與(yu)傳(chuan)統(tong)的(de)DNA固相合成一致，因此不特殊製備的化學試劑。
3 點樣法 點樣法是將合成好的探針、cNDA或基因組DNA通tong過guo特te定ding的de高gao速su點dian樣yang機ji器qi人ren直zhi接jie點dian在zai芯xin片pian上shang。點dian樣yang分fen子zi可ke以yi是shi核he酸suan也ye可ke以yi是shi寡gua核he酸suan。一yi些xie研yan究jiu者zhe采cai用yong人ren工gong點dian樣yang的de方fang法fa將jiang寡gua核he苷gan酸suan分fen子zi點dian樣yang於yu化hua學xue處chu理li後hou的de載zai玻bo片pian上shang，經jing一yi定ding的de化hua學xue方fang法fa處chu理li非fei幹gan燥zao後hou，寡gua核he苷gan酸suan分fen子zi即ji固gu定ding於yu載zai玻bo片pian上shang，製zhi備bei好hao的deDNA芯片可置於緩衝液中保存。由於方法費時費力，不適於大規模DNAxinpianzhizuo，yinershixianzidonghuadianyangjiuxiandeyouweizhongyao。youdeyanjiuzheyongduojulaiansuanbaobeiguxiangzhidaiwubopian，jingguofenquhouyongjisuanjikongzhideweizhenliedianyangjianzhaoyuxianshejishunxudianshanghesuanfenzi，dianyanglianghenxiao，yuewei5nl。大規模CDNA芯片多采用這種方法，與其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潛在優越性是具有更強的親和勢和特異性雜交，但是需要大量製備，純化，量化，分類PCR產物。有的研究者將玻片上覆蓋20μm厚薄層聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，采用機械刻寫或光刻的方法在其表麵劃上網格，並用激光照射蒸發掉單元間隙的多餘凝膠，以實現DNA芯片分區，單元大小為 40×40μm或 100×100μm間隔分別為50μm和100μm。然後將化學方法合成的寡核苷酸探針自動化點樣於各個單元內而製成DNA芯片，點樣速度可達2000單元/秒。
其裝置采用的機器人有一套計算機控製三維移動裝置、多個打印/噴印針的打印/噴印頭；一個減震底座，上麵可放內盛探針的多孔板和多個芯片。根據需要還可以有溫度和濕度控製裝置、針洗滌裝置。打印/噴(pen)印(yin)針(zhen)將(jiang)探(tan)針(zhen)從(cong)多(duo)孔(kong)板(ban)取(qu)出(chu)直(zhi)接(jie)打(da)印(yin)或(huo)噴(pen)印(yin)於(yu)芯(xin)片(pian)上(shang)。直(zhi)接(jie)打(da)印(yin)時(shi)針(zhen)頭(tou)與(yu)芯(xin)片(pian)接(jie)觸(chu)，而(er)在(zai)噴(pen)印(yin)時(shi)針(zhen)頭(tou)與(yu)芯(xin)片(pian)保(bao)持(chi)一(yi)定(ding)距(ju)離(li)。打(da)印(yin)法(fa)的(de)優(you)點(dian)是(shi)探(tan)針(zhen)密(mi)度(du)高(gao)，通(tong)常(chang)1平方厘米可打印2,500getanzhen。quedianshidingliangzhunquexingjizhongxianxingbuhao，dayinzhenyidusaiqieshiyongshoumingyouxian。penyinfadeyoudianshidingliangzhunque，zhongxianxinghao，shiyongshoumingchang。quedianshipenyindebandianda，yincitanzhenmidudi，tongchang1平方厘米隻有400點。國外有多家實驗室和公司研究開發打印/噴印設備，目前有一些已經商品化。軍事醫學科學院和益生堂生物企業公司目前正在聯手利用打印/噴印技術進行生物芯片的研究和開發，預計2年內將有用於實驗室研究或臨床診斷的基因芯片產品問世。見圖二。
4 電子芯片[8-10] 電子芯片是由美國Ｎanogen公司開發的，目前國內清華大學和複旦大學也在開發這一技術。這種芯片為帶有陽電荷的矽芯片、芯片經熱氧化，製成1mm×1mm的陣列、每(mei)個(ge)陣(zhen)列(lie)含(han)多(duo)個(ge)微(wei)電(dian)極(ji)，在(zai)每(mei)個(ge)電(dian)極(ji)上(shang)通(tong)過(guo)氧(yang)化(hua)矽(gui)沉(chen)積(ji)和(he)蝕(shi)刻(ke)製(zhi)備(bei)出(chu)樣(yang)品(pin)池(chi)。將(jiang)連(lian)接(jie)鏈(lian)親(qin)和(he)素(su)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)覆(fu)蓋(gai)在(zai)電(dian)極(ji)上(shang)，在(zai)電(dian)場(chang)作(zuo)用(yong)下(xia)生(sheng)物(wu)素(su)標(biao)記(ji)的(de)探(tan)針(zhen)即(ji)可(ke)結(jie)合(he)在(zai)特(te)定(ding)電(dian)極(ji)上(shang)。電(dian)子(zi)芯(xin)片(pian)最(zui)大(da)特(te)點(dian)是(shi)雜(za)交(jiao)速(su)度(du)快(kuai)，可(ke)大(da)大(da)縮(suo)短(duan)分(fen)析(xi)時(shi)間(jian)。製(zhi)備(bei)複(fu)雜(za)、成本高是其不足。
5 三維芯片[11-12] 三維芯片是由美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實驗室三家機構與俄羅斯Engelhardt分子生物學研究所合作開發的一種芯片技術。三維生物芯片實質上是一塊顯微鏡載玻片，其上有10,000個微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用於靶DNA，RNA和蛋白質的分析。先把乙知化合物加在凝膠條上，再用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。每個毛細管能把小到0.2nldetijidadaoningjiaoshang。yishangjijiajigouhezuoyanjiudeshengwuxinpianxitongjuyouqitashengwuxinpianxitongbujuyoudejigeyoudian。yishiningjiaodesanweihuanengjiajingengduodeyizhiwuzhi，zengjialeminganxing。ershikeyizaixinpianshangtongshijinxingkuozengyujianze。yibanqingkuangxia，bixuzaiweiliangduokongbanshangxianjinxingPCR擴增，再把樣品加到芯片上，因此需要進行許多額外操作。本芯片所用凝膠體積很小。使PCR擴增體係的體積減小1,000倍（總體積約納升級），從而節約了每個反應所用的PCR酶（約減少100倍）。三是以三維構象形式存在的蛋白和基因材料可以其天然狀態在凝膠條上分析，可以進行免疫測定，受體-配體研究和蛋白組分析。
6 流過式芯片（flow-thru chip）[13] Cene Logic正在開發一種在芯片片基上製成格柵狀微通道，Cene Logic設計及合成特定的寡核苷酸探針，結合於微通道內芯片的特定區域。從待測樣品中分離DNA或RNA並對其進行熒光標記，然後，該樣品流過芯片，固定的寡核苷酸探針捕獲與之相互補的核酸，采用Cene Logic's信號檢測係統分析結果。流通式芯片用於高通量分析已知基因的變化，其特定在於⑴敏感性高：由於寡核苷酸吸附表麵的增大，流過式芯片可監測稀有基因表達的變化；⑵速度快：微通道加速了雜交反應，減少了每次檢測所需時間；⑶價格降低：由於采用了特殊的共價化學技術將寡核苷酸吸附於微通道內，使每一種流過芯片可反複使用多次，從而使其成本降低。
四．基因芯片樣品製備
一般說來應用DNA芯片進行實驗包括5個過程：生物學問題的提出和芯片設計；樣品製備；生物雜交反應；結果探測；數據處理和建模。
1．樣品製備。一般所需mRNA的量是以一張表達譜芯片需要3μg mRNA計算的
不同組織抽提3－10μg mRNA所需組織量
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器官/組織* |
提取3μgmRNA所需組織量(克) |
提取10μgmRNA所需織量(克) |
總RNA得率[單位:毫克RNA/克組織] |
mRNA所占百分比[%] |
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成人正常組織 |
肝 |
0.2083 |
0.6944 |
1.80 - 1.80 mg/g |
0.80 |
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成人正常組織 |
腦 |
缺數據 |
缺數據 |
1.30 - 1.30 mg/g |
缺數據 |
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成人正常組織 |
肺 |
0.3000 |
1.0000 |
1.00 - 1.00 mg/g |
1.00 |
|
成人正常組織 |
心 |
0.5000 |
1.6667 |
0.60 - 0.60 mg/g |
1.00 |
|
成人正常組織 |
胃 |
0.1852 |
0.6173 |
2.70 - 2.70 mg/g |
0.60 |
|
成人正常組織 |
喉 |
0.3125 |
1.0417 |
1.20 - 1.20 mg/g |
0.80 |
|
病理組織 |
結腸癌 |
0.2521 |
0.8403 |
1.70 - 1.70 mg/g |
0.70 |
|
病理組織 |
胃癌 |
0.4317 |
1.4388 |
0.50 - 0.50 mg/g |
1.39 |
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病理組織 |
空腸腺癌 |
0.3571 |
1.1905 |
1.40 - 1.40 mg/g |
0.60 |
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病理組織 |
直腸癌 |
0.1604 |
0.5348 |
1.70 - 1.70 mg/g |
1.10 |
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病理組織 |
肝癌 |
0.1116 |
0.3720 |
3.84 - 3.84 mg/g |
0.70 |
|
病理組織 |
肺癌 |
0.1282 |
0.4274 |
2.00 - 2.00 mg/g |
1.17 |
考慮到個體差異以及樣品在研磨、勻漿等過程中的損失，客戶提供的樣品量應在上述基礎上增加1-2倍。
2 樣本采集過程關鍵點．
組織標本采集操作建議規程,(取標本所需關鍵器材和處理要求 )
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鋁箔 |
經DEPC水浸泡過夜，78°C烘幹，高壓滅菌後烘幹 |
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1.5 ml 微離心管 |
市場有售RNAase-Free的相應規格離心管 |
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標簽紙 |
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記號筆 |
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樣品登記表 |
由客戶指定專人填寫 |
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液氮罐 |
應常備液氮罐，並保證液氮的來源 |
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取材部位的病理切片 |
由客戶提供1-2張 |
注：
· 以下步驟1 － 5應在冰上進行且不超過15分鍾，超過時間會導致樣品的RNA降解。
· duizhongliuzuzhidequcai，yaoqiujinkenengzhunquedipandingzhongliuhezhengchangzuzhi，liruduiyushoushuqiechudezhenggehuobufenqianliexian，kenengyaogenjubingdongqiepianbaogaodejieguolaipandingyaojinxingyanjiudequcaibuwei。
1 離體新鮮組織，切成多個1cm3小塊，剔除結締組織和脂肪組織。胃、腸組織應剪除外膜；肝、腎、脾應剪除門部血管神經，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除幹淨（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除幹淨）。
2在RNase-Free 0.9％生理鹽水中漂洗樣品，以去除血漬和汙物。
3 用鋁箔包裹組織，或用5ml凍存管裝載組織(但最好統一采用鋁箔)。用記號筆在鋁箔或凍存管外表寫明樣品編號，並貼上標簽，迅速投入液氮冷卻。
4 填寫樣品登記表，寫明樣品名稱、種類、編號、取樣日期、樣品處理情況等
將液氮冷卻的組織放入樣品袋（每個樣品袋隻保存同樣的組織），袋口留一根編號繩，繩上粘一張標簽紙（標簽上注明：樣品名稱、編號、日期），迅速轉入便攜式液氮罐
5 保留1-2張取材部位的病理切片。
五.生物芯片雜交
待分析基因在與芯片結合探針雜交之前必需進行分離、擴增及標記。根據樣品來源、基因含量及檢測方法和分析目的不同，采用的基因分離、擴增及標記方法各異。當然，常規的基因分離、kuozengjibiaojijishuwanquankeyicaiyong，dancaozuofansuoqiefeishi。gaodujichengdeweixingyangpinchulixitongruxibaofenlixinpianjijiyinkuozengxinpiandengshishixianshangshumudedeyouxiaoshouduanhefazhanfangxiang。weilehuodejiyindezajiaoxinhaobixuduimudejiyinjinxingbiaoji，muqiancaiyongdezuipubiandeyingguangbiaojifangfayuchuantongfangfarutiwaizhuanlu、PCR、逆ni轉zhuan錄lu等deng原yuan理li上shang並bing無wu多duo大da差cha異yi，隻zhi是shi采cai用yong的de熒ying光guang素su種zhong類lei更geng多duo，這zhe可ke以yi滿man足zu不bu同tong來lai源yuan樣yang品pin的de平ping行xing分fen析xi。用yong計ji算suan機ji控kong製zhi的de高gao分fen辨bian熒ying光guang掃sao描miao儀yi可ke獲huo得de結jie合he於yu芯xin片pian上shang目mu的de基ji因yin的de熒ying光guang信xin號hao，通tong過guo計ji算suan機ji處chu理li即ji可ke給gei出chu目mu的de基ji因yin的de結jie構gou或huo表biao達da信xin息xi。
雜za交jiao條tiao件jian的de選xuan擇ze與yu研yan究jiu目mu的de有you關guan，多duo態tai性xing分fen析xi或huo者zhe基ji因yin測ce序xu時shi，每mei個ge核he苷gan酸suan或huo突tu變bian位wei點dian都dou必bi須xu檢jian測ce出chu來lai。通tong常chang設she計ji出chu一yi套tao四si種zhong寡gua聚ju核he苷gan酸suan，在zai靶ba序xu列lie上shang跨kua越yue每mei個ge位wei點dian，隻zhi在zai中zhong央yang位wei點dian堿jian基ji有you所suo不bu同tong，根gen據ju每mei套tao探tan針zhen在zai某mou一yi特te點dian位wei點dian的de雜za交jiao嚴yan謹jin程cheng度du，即ji可ke測ce定ding出chu該gai堿jian基ji的de種zhong類lei。如ru果guo芯xin片pian僅jin用yong於yu檢jian測ce基ji因yin表biao達da，隻zhi需xu設she計ji出chu針zhen對dui基ji因yin中zhong的de特te定ding區qu域yu的de幾ji套tao寡gua聚ju核he苷gan酸suan即ji可ke。表biao達da檢jian測ce需xu要yao長chang的de雜za交jiao時shi間jian，更geng高gao的de嚴yan謹jin性xing，更geng高gao的de樣yang品pin濃nong度du和he低di溫wen度du，這zhe有you利li於yu增zeng加jia檢jian測ce的de特te異yi性xing和he低di拷kao貝bei基ji因yin檢jian測ce的de靈ling敏min度du。突tu變bian檢jian測ce，要yao鑒jian別bie出chu單dan堿jian基ji錯cuo配pei，需xu要yao更geng高gao的de雜za交jiao嚴yan謹jin性xing和he更geng短duan的de時shi間jian。
此外，雜交反應還必須考慮雜交反應體係中鹽濃度、探針GC含量和所帶電荷、探針與芯片之間連接臂的長度及種類、檢測基因的二級結構的影響。有資料顯示探針和芯片之間適當長度的連接臂可使雜交效率提高150倍[9]。lianjiebishangrenhezhenghuofudianhedoujiangjianshaozajiaoxiaolv。youyutanzhenhejiancejiyinjundaifudianhe，yinciyingxiangtamenzhijiandezajiaojiehe，weiciyourentichuyongbudaidianhedetaihesuan（PNA）做探針[9]。雖然PNA的製備比較複雜，但與DNA探針比較有許多特點，如不需要鹽離子，因此可防止檢測基因二級結構的形成及自身複性。由於PNA-DNA結合更加穩定和特異，因此更有利於單堿基錯配基因的檢測。
六 基因芯片檢測原理
雜交信號的檢測是DNA芯片技術中的重要組成部分。以往的研究中已形成許多種探測分子雜交的方法，如熒光顯微鏡、隱逝波傳感器、光散射表麵共振、電化傳感器、化學發光、熒光各向異性等等，但並非每種方法都適用於DNA芯片。由於DNA芯片本身的結構及性質，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規模DNA芯片由於其麵積小，密度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupled device camera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。此外，大多數DNA芯xin片pian雜za交jiao信xin號hao譜pu型xing除chu了le分fen布bu位wei點dian以yi外wai還hai需xu要yao確que定ding每mei一yi點dian上shang的de信xin號hao強qiang度du，以yi確que定ding是shi完wan全quan雜za交jiao還hai是shi不bu完wan全quan雜za交jiao，因yin而er探tan測ce方fang法fa的de靈ling敏min度du及ji線xian性xing響xiang應ying也ye是shi非fei常chang重zhong要yao的de。雜za交jiao信xin號hao探tan測ce係xi統tong主zhu要yao包bao括kuo雜za交jiao信xin號hao產chan生sheng、信號收集及傳輸和信號處理及成像三個部分組成。
由you於yu所suo使shi用yong的de標biao記ji物wu不bu同tong，因yin而er相xiang應ying的de探tan測ce方fang法fa也ye各ge具ju特te色se。大da多duo數shu研yan究jiu者zhe使shi用yong熒ying光guang標biao記ji物wu，也ye有you一yi些xie研yan究jiu者zhe使shi用yong生sheng物wu素su標biao記ji，聯lian合he抗kang生sheng物wu素su結jie合he物wu檢jian測ceDNA化學發光。通過檢測標記信號來確定DNA芯片雜交譜型。
1．熒光標記雜交信號的檢測方法
使用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最(zui)成(cheng)熟(shu)。由(you)於(yu)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)可(ke)以(yi)選(xuan)擇(ze)性(xing)地(di)激(ji)發(fa)和(he)探(tan)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)混(hun)合(he)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)物(wu)，並(bing)具(ju)有(you)很(hen)好(hao)的(de)空(kong)間(jian)分(fen)辨(bian)率(lv)和(he)熱(re)分(fen)辨(bian)率(lv)，特(te)別(bie)是(shi)當(dang)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)中(zhong)使(shi)用(yong)了(le)共(gong)焦(jiao)激(ji)光(guang)掃(sao)描(miao)時(shi)，分(fen)辨(bian)能(neng)力(li)在(zai)實(shi)際(ji)應(ying)用(yong)中(zhong)可(ke)接(jie)近(jin)由(you)數(shu)值(zhi)孔(kong)徑(jing)和(he)光(guang)波(bo)長(chang)決(jue)定(ding)的(de)空(kong)間(jian)分(fen)辨(bian)率(lv)，而(er)在(zai)傳(chuan)統(tong)的(de)顯(xian)微(wei)鏡(jing)是(shi)很(hen)難(nan)做(zuo)到(dao)的(de)，這(zhe)便(bian)為(wei)DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。大多數方法都是在人射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎上發展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機的改進的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接製作在光纖維束切麵上並結合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質標記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交後經過SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩衝液清洗。
（1）激光掃描熒光顯微鏡
tancezhuangzhibijiaodianxing。fangfashijiangzajiaohoudexinpianjingchulihougudingzaijisuanjikongzhideerweichuandongpingtaishang，bingjiangyiwujingzhiyuqishangfang，youyalizijiguangqichanshengjifaguangjinglvbohoutongguowujingjujiaodaoxinpianbiaomian，jifayingguangbiaojiwuchanshengyingguang，guangbanbanjingyuewei5－10μm。tongshitongguotongyiwujingshoujiyingguangxinhaojinglingyilvbopianlvbohou，youlengquedeguangdianbeizengguantance，jingmoshuzhuanhuanbanzhuanhuanweishuzixinhao。tongguojisuanjikongzhichuandongpingtaiX－Y方向上步進平移，DNA芯片被逐點照射，所采集熒光信號構成雜交信號譜型，送計算機分析處理，最後形成20μm象素的圖像。這種方法分辨率高、圖像質量較好，適用於各種主要類型的DNA芯片及大規模DNA芯片雜交信號檢測，廣泛應用於基因表達、基因診斷等方麵研究。
(2)激光掃描共焦顯微鏡
激光掃描共焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結構非常相似，但是由於采用了共焦技術因而更具優越性。這種方法可以在熒光標記分子與DNA芯片雜交的同時進行雜交信號的探測，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡化了操作步驟大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人設計的DNA芯片即利用此方法。其方法是將靶 DNA分子溶液放在樣品地中，芯片上合成寡核苷酸陣列的一麵向下，與樣品池溶液直接接觸，並與DNA樣品雜交。當用激發光照射使熒光標記物產生熒光時，既有芯片上雜交的DNA樣品所發出的熒光，也有樣品地中DNAsuofachudeyingguang，ruhejiangliangzhefenlikailaishiyigefeichangzhongyaodewenti。ergongjiaoxianweijingjuyoufeichanghaodezongxiangfenbianlv，keyizaijieshouxinpianbiaomianyingguangxinhaodetongshi，bikaiyangpinchizhongyingguangxinhaodeyingxiang。yibancaiyongyalizijiguangqi（488nm）作zuo為wei激ji發fa光guang源yuan，經jing物wu鏡jing聚ju焦jiao，從cong芯xin片pian背bei麵mian入ru射she，聚ju集ji於yu芯xin片pian與yu靶ba分fen子zi溶rong液ye接jie觸chu麵mian。雜za交jiao分fen子zi所suo發fa的de熒ying光guang再zai經jing同tong一yi物wu鏡jing收shou集ji，並bing經jing濾lv波bo片pian濾lv波bo，被bei冷leng卻que的de光guang電dian倍bei增zeng管guan在zai光guang子zi計ji數shu的de模mo式shi下xia接jie收shou。經jing模mo數shu轉zhuan換huan反fan轉zhuan換huan為wei數shu字zi信xin號hao送song微wei機ji處chu理li，成cheng像xiang分fen析xi。在zai光guang電dian信xin增zeng管guan前qian放fang置zhi一yi共gong焦jiao小xiao孔kong，用yong於yu阻zu擋dang大da部bu分fen激ji發fa光guang焦jiao平ping麵mian以yi外wai的de來lai自zi樣yang品pin池chi的de未wei雜za交jiao分fen子zi熒ying光guang信xin號hao，避bi免mian其qi對dui探tan測ce結jie果guo的de影ying響xiang。激ji光guang器qi前qian也ye放fang置zhi一yi個ge小xiao孔kong光guang闌lan以yi盡jin量liang縮suo小xiao聚ju焦jiao點dian處chu光guang斑ban半ban徑jing，使shi之zhi能neng夠gou隻zhi照zhao射she在zai單dan個ge探tan針zhen上shang。通tong過guo計ji算suan機ji控kong製zhi激ji光guang束shu或huo樣yang品pin池chi的de移yi動dong，便bian可ke實shi現xian對dui芯xin片pian的de二er維wei掃sao描miao，移yi動dong步bu長chang與yu芯xin片pian上shang寡gua核he苷gan酸suan的de間jian距ju匹pi配pei，在zai幾ji分fen鍾zhong至zhi幾ji十shi分fen鍾zhong內nei即ji可ke獲huo得de熒ying光guang標biao記ji雜za交jiao信xin號hao圖tu譜pu。其qi特te點dian是shi靈ling敏min度du和he分fen辨bian率lv較jiao高gao，掃sao描miao時shi間jian長chang，比bi較jiao適shi合he研yan究jiu用yong。現xian在zai Affymetrix公司已推出商業化樣機，整套係統約 12萬美元。
（3）采用了CCD相機的熒光顯微鏡
這種探測裝置與以上的掃描方法都是基於熒光顯微鏡，但是以CCD相機作為信號接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動平台。由於不是逐點激發探測，因而激發光照射光場為整個芯片區域，由CCD相機獲得整個DNA芯(xin)片(pian)的(de)雜(za)交(jiao)譜(pu)型(xing)。這(zhe)種(zhong)方(fang)法(fa)一(yi)般(ban)不(bu)采(cai)用(yong)激(ji)光(guang)器(qi)作(zuo)為(wei)激(ji)發(fa)光(guang)源(yuan)，由(you)於(yu)激(ji)光(guang)束(shu)光(guang)強(qiang)的(de)高(gao)斯(si)分(fen)布(bu)，會(hui)使(shi)得(de)光(guang)場(chang)光(guang)強(qiang)度(du)分(fen)布(bu)不(bu)均(jun)，而(er)熒(ying)光(guang)信(xin)號(hao)的(de)強(qiang)度(du)與(yu)激(ji)發(fa)光(guang)的(de)強(qiang)度(du)密(mi)切(qie)相(xiang)關(guan)，因(yin)而(er)不(bu)利(li)於(yu)信(xin)號(hao)采(cai)集(ji)的(de)線(xian)性(xing)響(xiang)應(ying)。為(wei)保(bao)證(zheng)激(ji)發(fa)光(guang)勻(yun)場(chang)照(zhao)射(she)，有(you)的(de)學(xue)者(zhe)使(shi)用(yong)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)經(jing)濾(lv)波(bo)片(pian)濾(lv)波(bo)，通(tong)過(guo)傳(chuan)統(tong)的(de)光(guang)學(xue)物(wu)鏡(jing)將(jiang)激(ji)發(fa)光(guang)投(tou)射(she)到(dao)芯(xin)片(pian)上(shang)，照(zhao)明(ming)麵(mian)積(ji)可(ke)通(tong)過(guo)更(geng)換(huan)物(wu)鏡(jing)來(lai)調(tiao)整(zheng)；也有的研究者使用大功率弧形探照燈作為光源，使用光纖維束與透鏡結合傳輸激發光，並與芯片表麵呈50o角入射。由於采用了CCD相xiang機ji，因yin而er大da大da提ti高gao了le獲huo取qu熒ying光guang圖tu像xiang的de速su度du，曝pu光guang時shi間jian可ke縮suo短duan至zhi零ling點dian幾ji秒miao至zhi十shi幾ji秒miao。其qi特te點dian是shi掃sao描miao時shi間jian短duan，靈ling敏min度du和he分fen辨bian率lv較jiao低di，比bi較jiao適shi合he臨lin床chuang診zhen斷duan用yong[14].
（4）光纖傳感器
有的研究者將 DNA芯片直接做在光纖維束的切麵上（遠端），光纖維束的另一端（近端）經特製的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。光纖維束由7根單模光纖組成。每根光纖的直徑為200μm，兩(liang)端(duan)均(jun)經(jing)化(hua)學(xue)方(fang)法(fa)拋(pao)光(guang)清(qing)潔(jie)。化(hua)學(xue)方(fang)法(fa)合(he)成(cheng)的(de)寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)探(tan)針(zhen)共(gong)價(jia)結(jie)合(he)於(yu)每(mei)根(gen)光(guang)纖(xian)的(de)遠(yuan)端(duan)組(zu)成(cheng)寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)陣(zhen)列(lie)。將(jiang)光(guang)纖(xian)遠(yuan)端(duan)浸(jin)入(ru)到(dao)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)的(de)靶(ba)分(fen)子(zi)溶(rong)液(ye)中(zhong)與(yu)靶(ba)分(fen)子(zi)雜(za)交(jiao)，通(tong)過(guo)光(guang)纖(xian)維(wei)束(shu)傳(chuan)導(dao)來(lai)自(zi)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)激(ji)光(guang)（490urn），激發熒光標記物產生熒光，仍用光纖維束傳導熒光信號返回到熒光顯微鏡，由CCD相機接收。每根光纖單獨作用互不幹擾，而溶液中的熒光信號基本不會傳播到光纖中，雜交到光纖遠端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE緩衝液中浸泡10秒鍾去除，進而反複使用。這種方法快速、便捷，可實時檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由於光纖維束所含光纖數目有限，因而不便於製備大規模DNA芯片，有一定的應用局限性。
2.．生物素標記方法中的雜交信號探測
以生物素（biotin）標記樣品的方法由來已久，通常都要聯合使用其它大分子與抗生物素的結合物（如結合化學發光底物酶、熒光素等），再(zai)利(li)用(yong)所(suo)結(jie)合(he)大(da)分(fen)子(zi)的(de)特(te)殊(shu)性(xing)質(zhi)得(de)到(dao)最(zui)初(chu)的(de)雜(za)交(jiao)信(xin)號(hao)，由(you)於(yu)所(suo)選(xuan)用(yong)的(de)與(yu)抗(kang)生(sheng)物(wu)素(su)結(jie)合(he)的(de)分(fen)子(zi)種(zhong)類(lei)繁(fan)多(duo)，因(yin)而(er)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)也(ye)更(geng)趨(qu)多(duo)樣(yang)化(hua)。特(te)別(bie)是(shi)如(ru)果(guo)采(cai)用(yong)尼(ni)龍(long)膜(mo)作(zuo)為(wei)固(gu)相(xiang)支(zhi)持(chi)物(wu)，直(zhi)接(jie)以(yi)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)的(de)探(tan)針(zhen)用(yong)於(yu)DNA芯(xin)片(pian)雜(za)交(jiao)將(jiang)受(shou)到(dao)很(hen)大(da)的(de)限(xian)製(zhi)，因(yin)為(wei)在(zai)尼(ni)龍(long)膜(mo)上(shang)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)信(xin)號(hao)信(xin)噪(zao)比(bi)較(jiao)低(di)。因(yin)而(er)使(shi)用(yong)尼(ni)龍(long)膜(mo)作(zuo)為(wei)固(gu)相(xiang)支(zhi)持(chi)物(wu)的(de)這(zhe)些(xie)研(yan)究(jiu)者(zhe)大(da)多(duo)是(shi)采(cai)用(yong)生(sheng)物(wu)素(su)標(biao)記(ji)的(de)。
目前應用較多的是美國General Scanning公司開發的基因芯片專用檢測係統(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦掃描原理進行熒光信號采集，由計算機處理熒光信號，並對每個點的熒光強度數字化後進行分析。近期又開發出了ScanArray 5000，其掃描精度和功能有較大的提高。
七 結果的分析
樣品在被測定前，首先要經過消化，使待測組織細胞中的DNA或RNA釋放出來，在經過適當的擴增後，以熒光標記物標記，放入基因芯片自動孵育裝置（Fluidics Station）中，由其自動控製反應的時間、溫度以及緩衝液的配比等反應條件，進行雜交，這一過程，僅需要數秒鍾。雜交完成後，要對基因芯片進行“讀片”，jiyingyongjiguanggongjujiaoyingguangsaomiaoxianweijing，duijiyinxinpianbiaomiandemeigeweidianjinxingjiance。zhezhongxianweijing，jiangjujiaodepingmianshedingweixinpiandebiaomian，yincikeyijiancejiehedaoxinpianbiaomianweidiandeyangpinpianduandeyingguangbiaoji，erdaiceyangpinzhongweiyuxinpianshangtanzhenjiehedeyingguangbiaojiwu，zexuanfuyurongyezhong，youyubuzaijujiaopingmianshang，yinerbubeijiance。yangpinyutanzhendecuopeishiyingxiangzajiaofanyingjieguodezhongyaoyinsu，danyouyuyangpinyuxinpianshangdetanzhenzhengquepeiduishichanshengdeyingguangxinhaoyaobicuopeishiqiangdeduo，yinci，tongguoduixinhaoqiangdudefenxi，jiukeyiqufenzhengqueyucuowudepeidui。
為了使結果的檢驗更加簡便和快速，Affymetrixdejiyinxinpiandefenxixitongzhongcaiyonglejiyinzhenliesaomiaoyihezhuanyongdejiyinxinpiangongzuozhan，duiyifubaohanshuwangetanzhenweidiandejiyinxinpiantuyangdefenxi，jinxuyaoshufenzhongdeshijian。zheyangzaiduanduandejishifenzhongzhishuxiaoshinei，jiukeyiwanchengyongchuantongfangfaxuyaoshuyuecainengwanchengdejiwannaizhijishiwancizajiaofenxishiyan。
八 基因芯片的應用
（一）基因表達分析 基因芯片具有高度的敏感性和特異性，它可以監測細胞中幾個至幾千個mRNA拷貝的轉錄情況。與用單探針分析mRNA的點雜交技術不同，基因芯片表達探針陣列應用了大約20對寡核苷酸探針來監測每一個mRNA的轉錄情況。每對探針中，包含一個與所要監測的mRNA完全吻合和一個不完全吻合的探針（圖2），zhelianggetanzhendechabiezaiyuqizhongjianweizhidehegansuanbutong。zhezhongchengduidetanzhenkeyijiangfeiteyixingzajiaohebeijingxunhaojianxiaodaozuidideshuiping，youciwomenjiukeyiquedingnaxiediqiangdudemRNA。目前，Affymetrix公司已經生產出HugeneFL、Mu6500（含有小鼠6 500個基因）、Ye6100（含有酵母6 100個基因）等基因芯片成品。
1 分析基因表達時空特征。英國劍橋大學Whitehead研究所的Frank C.P. Holstegedengren，yingyonghanyoujiaomujiyinzudejiyinxinpian，shenruyanjiulezhenhexibaojiyinzudetiaojiezhouqi。yingyongjiyinzushuipingdebiaodafenxi，jiancenaxiebiaodashouzhuanluqishijizhideguanjianchengfenkongzhidejiyin，faxianRNA聚合酶II、主要的轉錄因子TFIID和SAGA染色體修飾複合物等均在基因的表達中有自己特定的作用位點[15]。通過本試驗，研究人員揭示了：（1）基因特異性的轉錄因子對表達的調控作用。（2）細胞在缺乏營養的環境中，基因不同位點的協同調節作用的全新機製。（3）xinhaozhuandaotongludezuizhongzuoyongweidian，zaizuichudejibuzhongjiukeyiqueding。yicishiyanweijichu，yanjiurenyuanjinyibuhuizhichulejiaomujiyinzukongzhitu，bingyoucifenxichulegezhongtiaojieyinzizaijiyinshangbutongdezuoyongweidianheqizuoyongdefenzijizhi。
美國Stanford大學的V.R.Iyer等人[16]，對成纖維細胞中與細胞增生和損傷修複有關的基因進行了分析。首先，他們用成纖維細胞中的8 600個基因片斷製成基因芯片的探針陣列，通過與mRNA反轉錄形成的cDNA的雜交反應，可以判斷出該基因的活性。在試驗中，成纖維細胞被置於無營養的環境中，使絕大部分基因的活性關閉，兩天後，加入10%的血清，24小時內，分6個不同的時間點，觀察基因的活化情況。試驗結果表明，在所有被監測的基因中，約有500個基因最為活躍，而使細胞保持不分裂狀態的基因活性被抑製。其中，最早被活化的是那些轉錄調控基因。在活化的基因中，有28個基因共同作用，控製細胞的增殖；8個與免疫反應的激活有關；19個與血管重建有關；lingyouxuduojiyin，yuxueguanxinshengmiqiexiangguan。zaizhongliuxibaozhong，jiyindebiaodayuzhengchangdexibaocunzaizhemingxiandechayi。tongguojiyinxinpianhuichujiyinbiaodadeshikongtupu，youzhuyurenleirenshishengminghuodongguochenghetezheng。
2 基因差異表達檢測〔17〕 生命活動中基因表達的改變是生物學研究的核心問題。理解人類基因組中10萬個不同的基因功能，監測某些組織、細胞不同分化階段的差異基因表達（differential gene expression ，DGE）十分重要。對差異表達的研究，可以推斷基因與基因的相互關係，細胞分化中基因“開啟”或“關閉”的機製；揭示基因與疾病的發生、發展、轉歸的內在聯係。目前DGE研究方法主要有表達序列標簽（ESTs）測序、差減克隆（subtractive cloning ）、差異顯示（differential display）、基因表達係列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微陣列雜交技術可監測大量mRNA的轉錄，直接快速地檢測出極其微量的mRNA，且易於同時監測成千上萬的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Rihn BH等利用基因芯片檢測胸膜間皮瘤與正常細胞間比較了6500個基因，，發現了300多個差異基因的表達。其中幾個典型基因的表達經RT-PCR進行定量後，可作為胸膜間皮瘤診斷的標記物（Markers）[18]。Sgroi〔19〕報告DNA芯片結合激光捕獲顯微切割技術（laser capture microdissection）用於乳癌浸潤期和轉移期及正常細胞的基因表達譜（gene expression profiles）差異研究，結果被定量PCR和免疫組化所證實。差異表達有助於早期發現瘤細胞3萬個基因與正常細胞的區別，有助於了解瘤細胞的發生、浸潤、轉移和藥敏。最近，美國毒物化學研究所（CIIT） 和國家環境健康科學研究所（NIEHS）正計劃在一張玻片上建立8 700個小白鼠cDNA芯片，用於肝癌的研究。我國也已成功研製出能檢出41 000種基因表達譜的芯片。美國Stanford大學的David Botstein利用cDNAweizhenliexinpian，duiruxianaixibaodejiyinbiaodajinxinglefenxi，faxianqijiyinbiaodashuipingmingxiandiyuzhengchangxibao。liyongjiyinxinpianduibiaodajinxingfenxi，zaiyicishiyanzhongkeyihuoquxiangdangyuzai60餘萬次傳統的Northern雜(za)交(jiao)中(zhong)所(suo)獲(huo)得(de)的(de)關(guan)於(yu)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)信(xin)息(xi)。通(tong)過(guo)這(zhe)種(zhong)實(shi)驗(yan)方(fang)法(fa)，可(ke)以(yi)建(jian)立(li)一(yi)種(zhong)全(quan)新(xin)的(de)腫(zhong)瘤(liu)分(fen)類(lei)學(xue)方(fang)法(fa)，即(ji)依(yi)據(ju)每(mei)個(ge)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)情(qing)況(kuang)對(dui)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)分(fen)類(lei)。基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)技(ji)術(shu)在(zai)分(fen)析(xi)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達(da)中(zhong)具(ju)有(you)不(bu)可(ke)比(bi)擬(ni)的(de)優(you)勢(shi)。
3 發現新基因 Moch等利用腫瘤微陣列芯片（5 184個cDNA片段）發現了腎細胞癌的腫瘤標誌物基因，並於正常細胞進行比較。在532份標本中檢測到胞漿纖維Vimentin的表達基因，陽性率為51%～61%〔20〕。追蹤觀察，有Vimentin表達的患者，預後極差。人類大量ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數據庫中400 000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析〔21〕。
定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發現可能的診斷及治療靶等方麵是很有價值的。如該技術在炎症性疾病類風濕性關節炎（RA）和炎症性腸病（IBD）的基因表達研究中，由RA或IBD組織製備探針，用Cy3和Cy5熒光素標記，然後與靶cDNA微陣列雜交，可檢測出炎症疾病誘導的基因如TNF-α、IL或粒細胞集落刺激因子，同時發現一些以前未發現的基因如HME基因和黑色素瘤生長刺激因子。Schena等人[22]報道了cDNA的微陣列在人類基因表達監測、生物學功能研究和基因發現方麵的應用。采用含1,046個已知序列的cDNA微wei陣zhen列lie，用yong高gao速su機ji器qi人ren噴pen印yin在zai玻bo片pian上shang，用yong雙shuang色se雜za交jiao法fa定ding量liang監jian測ce不bu同tong基ji因yin表biao達da，在zai一yi定ding的de實shi驗yan條tiao件jian下xia，不bu同tong表biao達da模mo式shi的de陣zhen列lie成cheng分fen通tong過guo序xu列lie分fen析xi鑒jian定ding其qi特te征zheng。該gai方fang法fa較jiao以yi往wang常chang用yong的de方fang法fa敏min感gan10倍以上，檢測限度為1:500,000(wt/wt)總人體mRNA。在培養T細胞熱休克反應的測定中，發現17個陣列成分的熒光比較明顯改變，其中11個受熱休克處理的誘導，6個呈現中度抑製，對相應於17個陣列成分的cDNA測序發現5個表達最高的成分是5種熱休克蛋白，17個克隆中發現3個新序列。另外，在佛波酯誘導檢測中[23]，發現有6個陣列成分信號增強超過2倍，測序及數據庫比較揭示有5個已知的，誘導表達最高的兩個是PCA-1酪氨酸磷酸酶和核因子-κB1，有一個是未知的。這4個新基因的表達水平均相對較低，僅呈現2倍的誘導。Northern雜交結果證實了微陣列的結果。進一步檢測了人的骨髓、腦、前列腺及心髒組織中熱休克和佛波酯調節基因的表達，4種組織中檢測出15種熱休克和佛波酯調節基因的表達，其表達水平與Jurkat細胞中相應成分的表達水平密切相關如在四種組織中表達水平最高的兩個基因β-actin和細胞色素C氧化酶在Jurkat細胞中的表達水平也很高。上述實驗提示在缺乏任何序列信息的條件下，微陣列可用於基因發現和基因表達檢測。目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數據庫中400,000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。
4 大規模DNA測序 人類基因組計劃的實施促進了高效的、自動化操作的測序方法的發展。芯片技術中雜交測序（sequencing by hybridization, SBH）技術及鄰堆雜交（contiguous stacking hybridization, CSH）技術即是一種新的高效快速測序方法[24-26]。用含65 536個8聚寡核苷酸的微陣列，采用SBH技術，可測定200 bp長DNA序列，采用67 108 864個13聚寡核苷酸的微陣列，可對數千個堿基長的DNA測序。SBH技ji術shu的de效xiao率lv隨sui著zhe微wei陣zhen列lie中zhong寡gua核he苷gan酸suan數shu量liang與yu長chang度du的de增zeng加jia而er提ti高gao，但dan微wei陣zhen列lie中zhong寡gua核he苷gan酸suan數shu量liang與yu長chang度du的de增zeng加jia則ze提ti高gao了le微wei陣zhen列lie的de複fu雜za性xing，降jiang低di了le雜za交jiao準zhun確que性xing。CSH技術彌補了SBH技術存在的弊端，CSH技術的應用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的DNA測序。計算機模擬論證了8聚寡核苷酸微陣列與5聚寡核苷酸鄰堆雜交，相當於13聚寡核苷酸微陣列的作用，可測定數千個核苷酸長的DNA序列[26]。Dubiley等人[26]將合成的10聚寡核苷酸固定於排列在載片表麵的0.1×0.1×0.02mm或1×1×0.02mm聚丙酰胺凝膠墊上製備聚寡核苷酸微陣列，先用分離微陣列（fractionation chips）進行單鏈DNA分離，再用測序微陣列（sequencing chips）分析序列，後者聯合采用了10聚寡核苷酸微陣列的酶促磷酸化、DNA雜交及與鄰堆的5聚寡核苷酸連接等技術。該方法可用於含重複序列及較長序列的DNA序列測定及不同基因組同源區域的序列比較。利用基因芯片測序的準確率達99%以上。
正如NIH首腦Harold Varmus在美國細胞生物學1998年年會上所說：“在基因芯片的幫助下，我們將能夠監測一個細胞乃至整個組織中所有基因的行為。”
（二）基因型、基因突變和多態性分析
zaitongyiwuzhongbutongzhongqunhegetizhijian，youzheduozhongbutongdejiyinxing，erzhezhongbutong，wangwangyugetidebutongxingzhuangheduozhongyichuanxingjibingyouzhemiqiedeguanxi。tongguoduidaliangjuyoubutongxingzhuangdegetidejiyinxingjinxingbijiao，jiukeyidechujiyinyuxingzhuangdeguanxi。danshi，youyudaduoshuxingzhuangheyichuanxingjibingshiyouduogejiyintongshijuedingde，yincifenxiqilaijiushifenkunnan，ranerjiyinxinpianjishuqiaqiajiejuelezheyiwenti，liyongqikeyitongshifanyingshuqianshenzhigengduogejiyindetexing，womenjiukeyifenxijiyinzuzhongbutongjiyinyuxingzhuanghuojibingdeguanxi。meiguoStanford大學的E.A.Winzeler等[27]，以兩種不同菌株的酵母（S96和YJM789）作為實驗材料，對控製酵母對放線菌酮的抗藥性的基因進行分析。將含有酵母150 000個DNA片斷的基因芯片分別與這兩株酵母活化轉錄的mRNA分子雜交，S96幾乎全部吻合，而YJM789與芯片上的探針組存在較大的差異，約有3000個位點沒有雜交顯色。由於S96對放線菌酮有抗藥性而YJM789的抗藥性則弱的多，因此可以判定控製這一抗藥性的基因的所在。而後，通過對S96和YJM789雜交後產生的抗藥子代的遺傳標記的分析，進一步確定，控製該抗藥性的基因位於15號染色體，是一長約57 000個堿基的片斷。美國國家人類基因組研究室的J.G.Hacia等在Fodor研究小組的協助下[28]，將基因芯片應用於雙色突變分析。他們的分析對象是與人類遺傳性乳腺癌和卵巢癌密切相關的BRCA1基因的外顯子11。在擴增後，將BRCA1基因的外顯子11置於含有熒光素-12-UTP的環境中進行體外轉錄反應，而後將轉錄產生的mRNA與BRCA1外顯子11芯片雜交，4小時後，用藻紅蛋白染色。在觀察時，用488nm的(de)氬(ya)離(li)子(zi)激(ji)光(guang)進(jin)行(xing)掃(sao)描(miao)，熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)位(wei)點(dian)呈(cheng)現(xian)綠(lv)色(se)，而(er)藻(zao)紅(hong)蛋(dan)白(bai)染(ran)色(se)的(de)位(wei)點(dian)呈(cheng)現(xian)紅(hong)色(se)。應(ying)用(yong)雙(shuang)色(se)分(fen)析(xi)，可(ke)以(yi)更(geng)為(wei)清(qing)楚(chu)的(de)監(jian)測(ce)未(wei)知(zhi)樣(yang)品(pin)與(yu)標(biao)準(zhun)鏈(lian)之(zhi)間(jian)的(de)競(jing)爭(zheng)性(xing)雜(za)交(jiao)情(qing)況(kuang)，進(jin)而(er)分(fen)析(xi)該(gai)基(ji)因(yin)中(zhong)的(de)不(bu)同(tong)突(tu)變(bian)。通(tong)過(guo)對(dui)15名患者BRCA1基因的觀察，有14名患者在外顯子11位點存在不同的突變。Hacia等［29］在1.28 cm×1.28 cm的芯片上固定了9.66×104個長度為20 nt的寡核苷酸探針，用於檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11 (3.45 kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5 bp)突變。針對每一個位點，共有28個獨立的探針，14個針對有義鏈，14個針對反義鏈。14個探針包括2個野生型，3個堿基置換、4個插入突變、5個堿基缺失。在15例患者樣品中，發現有14例有基因突變，類型包括點突變、插入及缺失等；在20例對照樣品中均未檢出假陽性結果，結果表明DNA芯片技術可快速、準確地研究大量患者樣品中特定基因所有可能的雜合變。Cronin等［30］分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導調節(CFTR)的突變，其中一個芯片包含1 480個探針，檢測了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變，包括缺失、插入和單堿基置換，並分析了10個未知樣品的CFTR基因，其結果與PCR-RELP的分析結果完全一致。
Guo等人[31]利用結合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸（ASOs）微陣列建立了簡單快速的基因多態性分析方法。將ASOs共價固定於玻璃載片上，采用PCR擴增基因組DNA，其一條引物用熒光素標記，另一條引物用生物素標記，分離兩條互補的DNA鏈，將熒光素標記DNA鏈與微陣列雜交，通過熒光掃描檢測雜交模式，即可測定PCR產物存在的多種多態性，該方法對人的酪氨酸酶基因等4個外顯子內含有的5個單堿基突變進行分析，結果顯示單堿基錯配與完全匹配的雜交模式非常易於區別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。β-地中海貧血中變異的檢測也論證了該方法的有效性和可信性[32]。Lipshutz等人[33]采用含18,495個寡核苷酸探針的微陣列，對HIV-1基因組反轉錄酶基因（rt）及蛋白酶基因（pro）的高度多態性進行了篩選。微陣列中內部探針與靶序列的錯配具有明顯的不穩定性，據此可快速區別核酸靶的差異。例如檢測序列5'GTATCAGCATXGCCATCGTGC中X堿基的種類，可用下列4種探針3'AGTCGTAACGGTAGC，3'AGTCGTACCGGTAGC，3'AGTCGTAGCGGTAGC，3'AGTCGTATCGGTAGC。高密度探針陣列可檢則具有特征性的較長序列相關的多態性與變異。篩選1,000個核苷酸序列的變異與多態性需要4,000個探針。用100μm合成位點，設計1.28cm2陣列，將有大約16,000個探針，能篩選4kb序列。HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易於發生多種變異，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現明顯抗性，因此檢測和分析rt與pro的變異與多態性具有重要的臨床意義。隨著遺傳病與癌症相關基因發現數量的增加，變異與多態性分析將越來越重要。Chee等［34］用含有1.35×105個長度為25 nt的寡核苷酸探針，分析了16.6 kb的人類線粒體基因組DNA(mt DNA)，共分析了10個樣本，檢測出了505個多態性位點，並在Leber′s遺傳性視神經疾病患者的mt DNA中檢測出3個致病性突變位點。
隨sui著zhe人ren類lei基ji因yin組zu計ji劃hua的de逐zhu步bu發fa展zhan，研yan究jiu人ren員yuan分fen析xi出chu了le越yue來lai越yue多duo的de基ji因yin序xu列lie。下xia一yi步bu，就jiu是shi要yao分fen析xi這zhe些xie基ji因yin的de多duo態tai性xing與yu生sheng物wu功gong能neng和he疾ji病bing的de關guan係xi，而er這zhe需xu要yao對dui大da量liang個ge體ti進jin行xing分fen析xi。通tong過guo基ji因yin芯xin片pianSNP（單核苷酸多態性）定(ding)位(wei)試(shi)驗(yan)，可(ke)以(yi)確(que)定(ding)基(ji)因(yin)多(duo)態(tai)性(xing)和(he)疾(ji)病(bing)的(de)關(guan)係(xi)，同(tong)時(shi)也(ye)可(ke)確(que)定(ding)致(zhi)病(bing)的(de)機(ji)製(zhi)和(he)病(bing)人(ren)對(dui)治(zhi)療(liao)的(de)反(fan)應(ying)等(deng)。同(tong)樣(yang)，對(dui)於(yu)許(xu)多(duo)與(yu)人(ren)類(lei)疾(ji)病(bing)密(mi)切(qie)相(xiang)關(guan)的(de)致(zhi)病(bing)微(wei)生(sheng)物(wu)，也(ye)可(ke)對(dui)其(qi)進(jin)行(xing)基(ji)因(yin)型(xing)和(he)多(duo)態(tai)性(xing)分(fen)析(xi)，1998年，法國T.Livache等[35]就成功的利用基因芯片技術，對人血中的HCV病毒進行了基因型分析。SNP基因芯片的成功將使臨床診斷上到一個新的台階。
（三）疾病的診斷與治療 人ren類lei的de疾ji病bing與yu遺yi傳chuan基ji因yin密mi切qie相xiang關guan，基ji因yin芯xin片pian可ke以yi對dui遺yi傳chuan信xin息xi進jin行xing快kuai速su準zhun確que的de分fen析xi，因yin此ci它ta在zai疾ji病bing的de分fen子zi診zhen斷duan中zhong的de優you勢shi是shi不bu言yan而er喻yu的de，就jiu臨lin床chuang一yi種zhong新xin的de、強有力的分子工具[36]。基因芯片技術已經被應用於感染性疾病、腫瘤和藥物代謝等方麵的研究。
1 遺傳病相關基因的定位 90年代以來,隨著人類基因組計劃的發展,各種方法被相繼創立並應用到基因定位中。我國有4 000萬育齡婦女，每年有2 000萬新生兒，準確檢測遺傳病基因是優生優育的技術保障。DNA芯片充分結合並靈活運用了大規模集成電路製造技術、自動化技術、計算機及網絡技術、激光共聚焦掃描、DNA合成、熒光標記探針、分子雜交及分子生物學的其它技術,在zai這zhe一yi領ling域yu的de研yan究jiu中zhong有you著zhe巨ju大da的de潛qian力li。這zhe一yi技ji術shu已yi成cheng為wei基ji因yin定ding位wei研yan究jiu的de高gao效xiao工gong具ju。隨sui著zhe遺yi傳chuan病bing與yu癌ai症zheng相xiang關guan基ji因yin發fa現xian數shu量liang的de增zeng加jia，變bian異yi與yu多duo態tai性xing分fen析xi將jiang越yue來lai越yue重zhong要yao。HGP使許多遺傳疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次篩查多種遺傳病,既經濟快速又敏感可靠[37,38]。
2 腫瘤診斷 已用基因芯片檢測人鼻咽癌、肺癌基因表達譜、腫瘤原癌基因和抑癌基因的發現和定位。早在1996年，M.J.Kozal等就利用基因芯片[39]，對HIV-I B亞型中的蛋白酶基因的多態性進行了分析，這也是基因芯片技術被首次應用於臨床實踐。在艾滋病的治療中，使用HIV蛋白酶抑製劑是一種重要的手段。然而，病毒對該藥物的反應卻有著很大的差異。利用基因芯片技術，研究人員分析了取自102個病人的167個病毒單體，發現這些同為美國HIV-I B亞種的病毒的基因序列存在極大差異，其中蛋白酶的基因片斷差異最大，在編碼99個氨基酸的序列中，竟有47.5%存在明顯突變。這些氨基酸的突變，直接導致了病毒抗藥性的不同。含96 600個20體寡核苷酸高密度陣列對遺傳性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11個外顯子進行雜合變異篩選，15個患者的已知變異的樣品中，準確診斷出14個患者，20個對照樣品中未發現假陽性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP調查42例有乳癌史的家係，p53基因13 964位的G變為C，突變率為7.1%；無乳癌家族史者為0。Favis等用多位PCR/連接酶檢測反應（PCR/LDR）在一個試管內同時檢測數百個基因突變，用於檢測大腸癌組織k-ras 和p53突變及BRCA-1和BRCA-2低頻率突變收到良好效果。
人類惡性腫瘤中，約有60%與人類p53抑癌基因的突變有關，目前研究人員已經研製成功了可以檢測p53基因所有編碼區（外顯子2～外顯子11）錯意突變和單堿基缺失突變的基因芯片。以外顯子7的第248個密碼子為例，野生型為CGG，在芯片上做出5條探針，相應位點分別為GAC、GCC、GGC、GTC和G-C，根據雜交後的熒光顯色圖，就可以分析出該位點為何種突變。
3 感染性疾病的診斷 HIV-1基因組中rt與pro在疾病過程中易於發生多種變異，這些變異將導致病毒對多種抗病毒藥物包括AZT、ddI、ddC等出現明顯抗性，因此檢測和分析rt與pro的變異與多態性具有重要的臨床意義。Hayward[40]以3 648個插入片段建立獵槍微陣列(shotgun microarray)，通過差異雜交和DNA測序找到了瘧原蟲無性和有性生殖階段基因差異表達，為抗瘧藥設計提供了線索。可以預測在不久的將來，人們可望在一張DNA芯片上檢測幾乎所有的病原微生物基因，實現真正意義上的“組合檢測（profile tests）”。
4 耐藥菌株和藥敏檢測 據WHO報告，全球每年約有800萬結核病患者，有300萬人死亡，死亡人數超過了艾滋病和瘧疾的總和。主要原因是菌株對不同的藥物產生了抗藥性（俄國80%TB對一種藥物產生抗性；美國50%為多重耐藥）。對每例患者進行菌株和藥敏鑒定是控製TB的關鍵。最近，俄美兩國科學家開發了具此功能的基因芯片，可使醫生及早使用敏感藥物。該芯片（TB Biochips）將抗性菌株的單鏈DNA標記後固定在玻片上，與待檢TB株雜交，臨床使用未見假陽性，該芯片可清洗後重複使用50次。
（四）藥物研究中的應用
從經濟效益來說，最大的應用領域可能是製藥廠用來開發新藥。所以已經有多家製藥企業介入芯片的開發。如： Incyte Pharmaaceuticals Inc.，Sequana Therapeutics，Millenium Pharmaceuticals Inc.等。對於尋找新藥來說，目標之一是應用芯片可以在基因水平上尋找藥物靶標。采用所謂“譯碼器”策略（Decoder strategy）來確定藥物靶標。從而找到“導向藥物”。基因芯片也被用於尋找蛋白激酶抑製物。細菌或腫瘤組織的耐藥性也涉及基因改變可以用DNA芯片鑒定。
1 新藥開發 高通量的DNA芯(xin)片(pian)可(ke)發(fa)現(xian)眾(zhong)多(duo)的(de)新(xin)基(ji)因(yin)和(he)新(xin)的(de)靶(ba)分(fen)子(zi)用(yong)於(yu)新(xin)藥(yao)的(de)設(she)計(ji)。噬(shi)菌(jun)體(ti)展(zhan)示(shi)技(ji)術(shu)可(ke)創(chuang)造(zao)大(da)量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，目(mu)前(qian)多(duo)用(yong)於(yu)抗(kang)體(ti)庫(ku)的(de)建(jian)立(li)和(he)篩(shai)選(xuan)，進(jin)而(er)可(ke)用(yong)於(yu)受(shou)體(ti)-配體相互作用的研究。基因組學、蛋白質組學和生物信息學（bioinformatics）將大大促進製藥工業的發展。目前第一個生物分子工程藥物Herceptin已用於乳癌的治療，並獲得美國FDA的批準。除腫瘤外，用分子生物工程設計的藥物可用於治療遺傳病及代謝疾病、抗衰老、設計新的抗生素和工業用酶等。
同時，有時一種藥物的作用是多方麵的，基因芯片有助於發現一種藥物的新的功能。原先設想的作用是針對某一靶標的，但在全基因或廣範圍篩選中卻發現該藥在另一方麵有很強的抑製作用，從而開發成另一種新藥。
2 調查藥物處理細胞後基因的表達情況
基因芯片在用來研究藥物的作用機理時十分有用。Marton[40]等人利用基因芯片構建了免疫抑製性藥物FK506處理酵母細胞後的基因表達圖譜。發現用FK506處理的酵母細胞基因表達圖譜與FK506靶標的無意義突變體相似。而用FK506去處理此突變體，發現了不同於野生型的作用機製。Clarke等［41］用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況，發現絲裂黴素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示，這類研究既有助於闡明藥物的作用機製，也有助於確定藥物作用的靶基因，為新藥研究, 提供線索。
3 對藥物進行毒性評價
應(ying)用(yong)芯(xin)片(pian)查(zha)找(zhao)藥(yao)物(wu)的(de)毒(du)性(xing)或(huo)副(fu)作(zuo)用(yong)，進(jin)行(xing)毒(du)理(li)學(xue)研(yan)究(jiu)。尤(you)其(qi)是(shi)慢(man)性(xing)毒(du)性(xing)和(he)副(fu)作(zuo)用(yong)，往(wang)往(wang)涉(she)及(ji)基(ji)因(yin)或(huo)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)的(de)改(gai)變(bian)。如(ru)果(guo)藥(yao)物(wu)能(neng)抑(yi)製(zhi)重(zhong)要(yao)基(ji)因(yin)的(de)表(biao)達(da)，則(ze)對(dui)它(ta)的(de)深(shen)入(ru)研(yan)究(jiu)就(jiu)值(zhi)得(de)考(kao)慮(lv)。用(yong)芯(xin)片(pian)作(zuo)大(da)規(gui)模(mo)的(de)表(biao)達(da)研(yan)究(jiu)往(wang)往(wang)可(ke)省(sheng)略(lve)大(da)量(liang)的(de)動(dong)物(wu)試(shi)驗(yan)。若(ruo)某(mou)個(ge)正(zheng)在(zai)篩(shai)選(xuan)的(de)潛(qian)在(zai)藥(yao)物(wu)作(zuo)用(yong)靶(ba)細(xi)胞(bao)得(de)到(dao)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)圖(tu)譜(pu)與(yu)已(yi)知(zhi)的(de)具(ju)有(you)毒(du)性(xing)副(fu)作(zuo)用(yong)的(de)藥(yao)物(wu)得(de)到(dao)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)圖(tu)譜(pu)相(xiang)似(si)時(shi)，就(jiu)要(yao)考(kao)慮(lv)是(shi)否(fou)停(ting)止(zhi)藥(yao)物(wu)開(kai)發(fa)（drug development）中花費巨大的臨床實驗階段。Nuwaysir等［42］研製了包括涉及細胞凋亡、DNA複製和修複、氧化應激/氧化還原內穩態、過氧化物酶體增殖反應、二?英/多環芳烴反應、雌激素反應、看家基因、癌基因和抑癌基因、細胞周期控製、轉錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細胞色素P450等共2 090個基因的毒理芯片(ToxChip v1.0), 該芯片既可用於毒物的檢測和遺傳多態性的檢測，又可用於受檢毒物的毒作用機製的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學相關基因的cDNA克隆，製備了種屬特異的毒理基因組學芯片，可研究肝髒毒性、內分泌幹擾、致癌作用等毒性終點的作用機製，也可用於確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性。
（五）基因芯片中醫學領域中的應用
中醫學中應用基因芯片技術，還處於初始階段，目前主要集中以下三個方麵：
1中藥的研究，具體的方法，同上述藥物篩選方法類似。尤其中藥中眾多成分中有效成分的篩選、有效藥物的篩選、中(zhong)藥(yao)毒(du)理(li)學(xue)過(guo)程(cheng)均(jun)被(bei)大(da)大(da)簡(jian)化(hua)，將(jiang)推(tui)動(dong)中(zhong)藥(yao)的(de)迅(xun)猛(meng)發(fa)展(zhan)。中(zhong)藥(yao)學(xue)引(yin)入(ru)基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)技(ji)術(shu)，將(jiang)大(da)大(da)推(tui)動(dong)中(zhong)藥(yao)研(yan)究(jiu)的(de)國(guo)際(ji)化(hua)進(jin)程(cheng)，為(wei)闡(chan)明(ming)中(zhong)藥(yao)作(zuo)用(yong)機(ji)理(li)，具(ju)有(you)無(wu)可(ke)估(gu)量(liang)的(de)重(zhong)要(yao)意(yi)義(yi)。
2中醫“證”本質的研究。中醫“證”的中醫藥的臨床治療的核心，但“證”的本質研究一直難以有重大進展。主要因為中醫理論設及到生命的整體，因而它牽涉到許多基因和蛋白質，傳統的方法學無法弄清“證”的實質，而利用基因芯片技術，對不同“證”狀態的基因組進行掃描，再繪出不同證的基因表達譜，通過相關分析，可望獲得一些有意義的成果。也是從分子基因水平全麵揭示“證”本質提供了可能。如果證本質被揭示，它可能會引起醫學治療學理論的重大革新或變化，尤其是個體化治療方案可能重新被重視。
3針灸原理研究。針灸的原理設及全身各個部分，針灸不同方法、不同穴位、經jing絡luo是shi否fou具ju有you不bu同tong的de作zuo用yong，也ye即ji經jing脈mai與yu髒zang腑fu間jian的de相xiang關guan聯lian係xi是shi否fou具ju有you相xiang對dui特te異yi性xing。通tong過guo基ji因yin芯xin片pian測ce量liang不bu同tong組zu織zhi基ji因yin表biao達da的de差cha異yi，判pan斷duan基ji因yin表biao達da是shi否fou具ju有you特te異yi性xing，有you望wang解jie決jue這zhe一yi長chang期qi爭zheng論lun不bu休xiu的de問wen題ti。如ru果guo心xin經jing與yu心xin髒zang具ju有you相xiang對dui特te異yi性xing，那na麼me針zhen刺ci心xin經jing後hou，心xin髒zang內nei可ke能neng會hui出chu現xian某mou些xie與yu針zhen刺ci相xiang關guan的de特te異yi性xing基ji因yin表biao達da，而er且qie，這zhe種zhong表biao達da隻zhi在zai針zhen刺ci心xin經jing時shi出chu現xian，這zhe些xie基ji因yin可ke能neng不bu在zai其qi它ta器qi官guan，如ru肝gan髒zang中zhong表biao達da。那na麼me可ke以yi肯ken定ding地di認ren為wei經jing脈mai髒zang腑fu相xiang關guan是shi具ju有you相xiang對dui特te異yi性xing的de，也ye可ke以yi認ren為wei傳chuan統tong經jing絡luo理li論lun是shi有you依yi據ju的de。
另一方麵，基因芯片還有助於揭示針灸的作用機製。針灸的作用是與神經內分泌免疫網絡係統（NEI networks）密切相關的，它設及到細胞信使、神經遞質、調質、神經肽、細胞因子、neifenmijisudengduozhongyinzi，danzhenjiudexinhaoshiruhezaixibaojianhexibaoneichuandideguochengrengbuminglang，ruguoyinrujiyinxinpian，keyigaotongliangdejiancexibaoneijiyinbiaodadeshikongtezheng，youzhuyulejiezhenjiucujinjiyinbiaodadetedian，jinerzailiyongdanbaizuxuexiangguanjishu，jieshizhenjiuzuoyongyuanli。xianzaiyiyoubufengongzuozhengzaijinxing。
（六）其它應用
1環境化學毒物的篩選 我(wo)們(men)的(de)生(sheng)活(huo)環(huan)境(jing)中(zhong)存(cun)在(zai)著(zhe)數(shu)千(qian)種(zhong)化(hua)學(xue)物(wu)質(zhi)，每(mei)種(zhong)物(wu)質(zhi)在(zai)投(tou)入(ru)使(shi)用(yong)前(qian)必(bi)須(xu)進(jin)行(xing)人(ren)體(ti)毒(du)性(xing)試(shi)驗(yan)，傳(chuan)統(tong)的(de)動(dong)物(wu)試(shi)驗(yan)費(fei)用(yong)高(gao)昂(ang)，且(qie)存(cun)在(zai)著(zhe)國(guo)際(ji)上(shang)關(guan)注(zhu)的(de)動(dong)物(wu)福(fu)利(li)（animal welfare）問題。采用毒物檢測芯片（Toxchips）可對環境中眾多化學物質對人類基因的潛在毒性進行篩選，探查毒物“開啟”或“關閉”哪些基因，研究“環境如何改變我們的基因”。NIEHS將對人類100 000個基因中的12 000個基因進行檢測，弄清致癌物質對基因的改變，建立化學物質指紋庫（fingerprints of chemicals），然後即可通過測定特定基因的突變與否判斷新的合成物質的生物毒性。
2體ti質zhi醫yi學xue的de研yan究jiu。體ti質zhi醫yi學xue關guan係xi到dao個ge體ti化hua治zhi療liao的de核he心xin問wen題ti，不bu同tong的de人ren具ju有you不bu同tong的de體ti質zhi基ji礎chu，其qi原yuan因yin與yu基ji因yin型xing可ke能neng存cun在zai一yi定ding的de相xiang關guan性xing，尤you其qi可ke能neng與yuSNP關係較大，如何全麵了解人的SNP差異，以及它與體質因素、疾病的易感性間關係，是值得研究的重大課題。
九 國內外基因芯片生產情況
美國繼開展人類基因組計劃以後，於1998年正式啟動基因芯片計劃，美國國立衛生部、能源部、商業部、司法部、國防部、中央情報局等均參與了此項目。同時斯坦福大學、麻省理工學院及部分國立實驗室如Argonne Oakridge也參與了該項目的研究和開發。英國劍橋大學、歐亞公司正在從事該領域的研究。世界大型製藥公司尤其對基因芯片技術用於基因多態性、疾病相關性、基(ji)因(yin)藥(yao)物(wu)開(kai)發(fa)和(he)合(he)成(cheng)或(huo)天(tian)然(ran)藥(yao)物(wu)篩(shai)選(xuan)等(deng)領(ling)域(yu)感(gan)興(xing)趣(qu)，都(dou)已(yi)建(jian)立(li)了(le)或(huo)正(zheng)在(zai)建(jian)立(li)自(zi)己(ji)的(de)芯(xin)片(pian)設(she)備(bei)和(he)技(ji)術(shu)。目(mu)前(qian)全(quan)世(shi)界(jie)有(you)幾(ji)百(bai)家(jia)基(ji)因(yin)芯(xin)片(pian)公(gong)司(si)，有(you)多(duo)種(zhong)生(sheng)物(wu)芯(xin)片(pian)問(wen)世(shi)，而(er)且(qie)這(zhe)些(xie)芯(xin)片(pian)的(de)特(te)點(dian)較(jiao)以(yi)前(qian)密(mi)度(du)更(geng)高(gao)，檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)更(geng)精(jing)確(que)，特(te)異(yi)性(xing)更(geng)強(qiang)的(de)特(te)點(dian)。而(er)主(zhu)要(yao)仍(reng)以(yi)少(shao)數(shu)幾(ji)家(jia)公(gong)司(si)為(wei)主(zhu)，如(ru)Affymetrix、Brax、Hysep等。國內目前主要如清華大學（陳京）、中科院生命科學院、上海複旦大學、北京軍事科學院、南京東南大學、西安等四十餘家公司，而且可能還有一大批公司相繼成立。
主要DNA芯片高科技術企業的開發善和各自技術特點(1998年)[43]
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公司 |
排陣方法 |
結果讀出 |
主要方向 |
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Affymetrix(Santa Clara,CA) |
單片照相平板印刷法在1.25cm2或5.25cm2薄矽片上合成20～25mer寡核苷酸 |
熒光 |
表達譜，多態性分析，診斷 |
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Brax(Cambridge,UK) |
短合成寡核苷酸，離片合成 |
質譜儀 |
表達譜，新基因鑒定，診斷 |
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Hysep(Sunnyvale,CA) |
500～2000nt的DNA樣品打印在0.6cm2(HyGnostics)或～18cm2(Gene Discovery)的膜上 預製5mer寡核苷酸在玻璃上打印或1.15cm2陣列（HyChip) |
放射性同位素 熒光 |
表達譜，新基因鑒定，診斷（HyGnostics/ HyChip Array） |
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Incyte Pharmaceuticals(Palo,Alto,CA) |
噴墨式打印PCR片段和在片合成 |
熒光和放射性同位素
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表達譜，多態性分析，診斷 |
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Molecular Dynamics(Sunnyvale,CA) |
筆式撈錢500～5000nt cDNAs於玻璃片上～10cm2` |
熒光 |
表達譜，新基因鑒定 |
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Nanogen (San Diego,CA) |
電活性點捕捉預製的～20mer寡核苷酸到≤1cm2矽膜薄片上 |
熒光 |
診斷短片段串聯重複序列鑒定 |
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Protogene Laboratories (Palo,Alto,CA) |
通過打印表麵張力陣列在片合成40～50mer寡核苷酸於9cm2玻璃片上 |
熒光 |
表達譜，多態性分析 |
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Sequenom(Hamburg,Germany and San Diego,CA) |
背麵蹭髒膠印法陣列；20～25mer |
質譜儀 |
新基因鑒定，侯選基因確證，診斷，作圖 |
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Synteri(Fremont,CA) |
500～5000nt cDNA打印下於～4cm2玻璃片上 |
熒光 |
表達譜，新基因鑒定 |
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German Cancer Instiute(Hedelberg,Germany) |
用f-moc或t-moc化學在片（原型PNA巨片）合成 |
熒光/質譜儀 |
表達譜/診斷 |
十 當前麵臨的困難
盡管基因芯片技術已經取得了長足的發展，得到人們的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術成本昂貴、複雜、檢測靈敏度較低，重複性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現在樣品的製備、探針合成與固定、分子的標記、數據的讀取與分析等幾個方麵。
1樣(yang)品(pin)製(zhi)備(bei)上(shang)，當(dang)前(qian)多(duo)數(shu)公(gong)司(si)在(zai)標(biao)記(ji)和(he)測(ce)定(ding)前(qian)都(dou)要(yao)對(dui)樣(yang)品(pin)進(jin)行(xing)一(yi)定(ding)程(cheng)度(du)的(de)擴(kuo)增(zeng)以(yi)便(bian)提(ti)高(gao)檢(jian)測(ce)的(de)靈(ling)敏(min)度(du)，但(dan)仍(reng)不(bu)少(shao)人(ren)在(zai)嚐(chang)試(shi)繞(rao)過(guo)該(gai)問(wen)題(ti)，這(zhe)包(bao)括(kuo)Mosaic Technologies公司的固相PCR擴拉體係以及Lynx Therapeutics公司提出大量並行固相克隆方法，兩種方法各有優缺點，但目前尚未取得實際應用。
2 探針的合成與固定比較複雜，特別是對於製作高密度的探針陣列。使用光導聚合技術每步產率不高（95%），難於保證好的聚合效果。應運而生的其它很多方法，如壓電打壓、微(wei)量(liang)噴(pen)塗(tu)等(deng)多(duo)項(xiang)技(ji)術(shu)，雖(sui)然(ran)技(ji)術(shu)難(nan)度(du)較(jiao)低(di)方(fang)法(fa)也(ye)比(bi)較(jiao)靈(ling)活(huo)，但(dan)存(cun)在(zai)的(de)問(wen)題(ti)是(shi)難(nan)以(yi)形(xing)成(cheng)高(gao)密(mi)度(du)的(de)探(tan)針(zhen)陣(zhen)列(lie)，所(suo)以(yi)隻(zhi)能(neng)在(zai)較(jiao)小(xiao)規(gui)模(mo)上(shang)使(shi)用(yong)。最(zui)近(jin)我(wo)國(guo)學(xue)者(zhe)已(yi)成(cheng)功(gong)地(di)將(jiang)分(fen)子(zi)印(yin)章(zhang)技(ji)術(shu)應(ying)用(yong)探(tan)針(zhen)的(de)原(yuan)位(wei)合(he)成(cheng)而(er)且(qie)取(qu)得(de)了(le)比(bi)較(jiao)滿(man)意(yi)的(de)結(jie)果(guo)。
3目標分子的標記也是一個重要的限速步驟，如何簡化或繞過這一步現在仍然是個問題。目標分子與探針的雜交會出現一些問題：首先，由於雜交位於固相表麵，所以有一定程度的空間阻礙作用，有必要設法減少這種不利因素的影響。Southern曾通過向探針中引入間隔分子而使雜交效率提高於150倍。其次，探針分子的GC含量、長度以及濃度等都會對雜交產生一定的影響，因此需要分別進行分析和研究。
4信號的獲取與分析上，當前多數方法使用熒光法進行檢測和分析，重複性較好，但靈敏仍然不高。正在發展的方法有多種，如質譜法、化hua學xue發fa光guang法fa等deng。基ji因yin芯xin片pian上shang成cheng千qian上shang萬wan的de寡gua核he苷gan酸suan探tan針zhen由you於yu序xu列lie本ben身shen有you一yi定ding程cheng度du的de重zhong疊die因yin而er產chan生sheng了le大da量liang的de豐feng餘yu信xin息xi。這zhe一yi方fang麵mian可ke以yi為wei樣yang品pin的de檢jian測ce提ti供gong大da量liang的de難nan證zheng機ji會hui，但dan同tong時shi，要yao對dui如ru此ci大da量liang的de信xin息xi進jin行xing解jie讀du，目mu前qian仍reng是shi一yi個ge艱jian巨ju的de技ji術shu問wen題ti。
5基因芯片的特異性還有待提高。最近Affymetrix公司生產的基因芯片采用瓣的技術，已大大提高檢測的特異性，估計在今後幾年內基因芯片的特異性將大大提高。
6如何檢測低豐度表達基因仍是目前一個重要問題。基因芯片要保證其特異性、但(dan)又(you)要(yao)保(bao)證(zheng)能(neng)檢(jian)測(ce)低(di)豐(feng)度(du)表(biao)達(da)的(de)基(ji)因(yin)，目(mu)前(qian)尚(shang)未(wei)解(jie)決(jue)這(zhe)一(yi)問(wen)題(ti)。因(yin)為(wei)許(xu)多(duo)低(di)豐(feng)度(du)表(biao)達(da)的(de)基(ji)因(yin)，也(ye)可(ke)能(neng)表(biao)達(da)出(chu)主(zhu)要(yao)執(zhi)行(xing)效(xiao)應(ying)功(gong)能(neng)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)。因(yin)為(wei)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)與(yu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)生(sheng)成(cheng)並(bing)不(bu)成(cheng)比(bi)例(li)。
上shang述shu問wen題ti不bu僅jin是shi當dang前qian和he今jin後hou一yi段duan時shi期qi內nei國guo內nei外wai基ji因yin芯xin片pian技ji術shu研yan究jiu的de焦jiao點dian，同tong時shi也ye是shi基ji因yin芯xin片pian能neng否fou從cong實shi驗yan室shi研yan究jiu推tui向xiang臨lin床chuang應ying用yong的de關guan鍵jian問wen題ti。
十一 基因芯片技術的研究可能方向
縱觀當前基因芯片的研究趨勢，基因芯片在今後幾年內可能的發展方向，可能有以下幾個方麵：
1．進一步提高探針陣列的集成度，如有多家公司的芯片陣列的集成度已達1.0×105左右，這樣基因數量在1.0×105以下的生物體（大多數生物體）的基因表達情況隻用一塊芯片即可包括。
2 提高檢測的靈敏度和特異性。如檢測係統的優化組合和采用高靈敏度的熒光標誌。多重檢測以提高特異性，減少假陽性。
4高自動化、方法趨於標準化、簡單化，成本降低。價格高昂是目前推廣應用的主要障礙之一，但隨著技術的革新，基因芯片的價格將會大大降低。
5高穩定性。寡核苷酸探針、RNA均不穩定，易受破壞。而肽核酸（PNA）有望取代普通RNA/DNA探針，可以確保探針的高穩定性。
6 研製新的應用芯片，如1999年美國環保局(EPA)組織專家研討會，討論了毒理學芯片的發展策略。近來多種新的生物芯片不斷問世，這是物理學、生物學與計算機科學共同的結晶。
7 研製芯片新檢測係統和分析軟件，以充分利用生物信息。
8 芯片技術將與其它技術結合使用，如基因芯片PCR、納米芯片等。
9不同生物芯片間綜合應用，如蛋白質芯片與基因芯片間相互作用等，可用於了解蛋白質與基因間相互作用的關係。
當前，基因芯片數量呈幾何級數在增長，功能也日益完善，但價格卻大大降低。可以預見，基因芯片可能在未來3-5年，也即到2005年左右，將在醫學和生物學領域中得到廣泛應用，甚至普及使用！到2010年它可能成為常規的實驗技術，正如個人電腦的迅速普及一樣。
基因芯片作為生物芯片的代表，其發展目標同生物芯片的目標一樣是“芯片實驗室”(Lab-on-chip)，也即將整個生化檢測分析過程縮微到芯片上。“芯片實驗室”通過微細加工工藝製作的微濾器、微反應器、微泵、微閥門、微電極等以實現對生物樣品從製備、生sheng化hua反fan應ying到dao檢jian測ce和he分fen析xi的de全quan過guo程cheng，而er且qie實shi驗yan過guo程cheng趨qu於yu自zi動dong化hua從cong而er極ji大da地di縮suo短duan的de檢jian測ce和he分fen析xi時shi間jian，節jie省sheng了le實shi驗yan材cai料liao，而er且qie又you降jiang低di人ren為wei主zhu觀guan因yin素su，大da大da提ti高gao實shi驗yan的de客ke觀guan性xing。
總之，基因芯片技術發展到今天不過短短幾年時間，雖然還存在這樣或那樣的問題，但其在基因表達譜分析、基因診斷、yaowushaixuanjixuliefenxidengzhuduolingyuyichengxianchuguangkuodeyingyongqianjing，suizheyanjiudebuduanshenruhejishudegengjiawanshanjiyinxinpianyidinghuizaishengmingkexueyanjiulingyufahuichuqifeifandezuoyong。基ji因yin芯xin片pian最zui終zhong的de意yi義yi和he目mu的de不bu再zai於yu本ben身shen，而er在zai於yu它ta極ji大da地di提ti高gao了le人ren類lei認ren識shi生sheng命ming本ben質zhi的de能neng力li和he手shou段duan，為wei揭jie示shi人ren類lei這zhe個ge複fu雜za網wang絡luo係xi統tong打da下xia基ji礎chu。從某種意義上我們可以這樣認為：基因的結構或種類決定物種；基因的功能或表達則決定生命，即生物的生、老、病、死si。基ji因yin芯xin片pian技ji術shu將jiang為wei我wo們men提ti供gong一yi條tiao認ren識shi生sheng命ming本ben質zhi的de捷jie徑jing。當dang然ran基ji因yin芯xin片pian並bing非fei萬wan能neng，基ji因yin的de表biao達da並bing非fei代dai表biao生sheng命ming活huo動dong本ben質zhi，生sheng命ming執zhi行xing者zhe應ying是shi蛋dan白bai質zhi，因yin而er基ji因yin芯xin片pian必bi需xu同tong蛋dan白bai組zu學xue相xiang關guan技ji術shu，如ru二er維wei凝ning膠jiao電dian泳yong、蛋白質芯片、大規模雙雜交體係等相結合才有望真正揭示生命活動的時空過程。
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